本研究由James Duehr、Meagan McMahon、Brandi Williamson、Fatima Amanat、Alan Durbin、David W. Hawman、Danny Noack、Skyler Uhl、Gene S. Tan、Heinz Feldmann和Florian Krammer等人完成，主要作者来自西奈山伊坎医学院微生物学系、洛克山实验室病毒学实验室以及J. Craig Venter研究所。该研究于2020年3月24日发表在mBio期刊上，论文题为“Neutralizing monoclonal antibodies against the Gn and the Gc of the Andes virus glycoprotein spike complex protect from virus challenge in a preclinical hamster model”。

汉坦病毒是引起肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS）和汉坦病毒心肺综合征（hantavirus cardiopulmonary syndrome, HCPS）的病原体。其中HCPS的病死率高达30%至50%，每年在美洲约有300例报告病例。2018年11月以来，阿根廷丘布特省埃普延及其周边地区暴发了规模空前的HCPS疫情，至少29例实验室确诊病例，且高度怀疑存在人际传播。尽管汉坦病毒对公共卫生构成严重威胁，但目前尚无获批的治疗药物或疫苗。安第斯病毒（Andes virus, ANDV）是此次埃普延疫情的病原体，其表面糖蛋白复合物由Gn和Gc组成，是病毒进入宿主细胞的关键结构，也是中和抗体的主要靶点。然而，针对ANDV GnGc的中和性和保护性单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs）极为缺乏，这严重制约了对该病毒抗原性、融合机制以及抗病毒治疗策略的研究。

为了解决上述问题，研究者开展了系统的单克隆抗体筛选与鉴定工作。首先，采用两种不同的鼠源免疫策略来诱导针对Gn和Gc的抗体：第一种为同源免疫方案，即先用表达ANDV全长GnGc的DNA疫苗免疫BALB/c小鼠，再用表达ANDV糖蛋白的重组水疱性口炎病毒（VSV-ANDV）加强免疫，目的是诱导以Gn为主的抗体应答；第二种为异源免疫方案，依次用汉滩病毒、ANDV和普马拉病毒的GnGc DNA疫苗进行序贯免疫，最后以VSV-ANDV加强，以利用Gn基因的高变异性来驱动对较为保守的Gc的抗体反应。随后，取免疫小鼠脾细胞与SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫细胞染色筛选，最终获得了17株特异性识别ANDV GnGc的IgG单克隆抗体，其中8株来自同源免疫方案，9株来自异源免疫方案。

在抗体结合特性方面，研究采用ELISA对纯化的VSV-ANDV颗粒和重组可溶性Gn蛋白进行结合检测。结果显示，19株单克隆抗体中有12株能够结合纯化病毒颗粒，5株能够结合重组Gn蛋白，4株来自同源免疫方案，1株来自异源方案。通过蛋白质印迹（Western blot）分析，部分抗体在非还原条件下能够识别分子量约28 kDa和50 kDa的蛋白条带，分别可能对应线性化的Gn和Gc，其中一株抗体在还原条件下失去结合能力，提示其表位具有构象依赖性。在中和活性方面，所有结合纯化VSV-ANDV的抗体均在病灶减少中和试验（focus-forming unit reduction neutralization assay, FRNA）中对VSV-ANDV表现出中和能力，并且所有中和抗体也能中和真实的ANDV，说明重组病毒和真实病毒表面的中和表位表达一致。半数抑制浓度（IC50）数据显示多数抗体的中和活性在两种病毒间相似。此外，通过抗体依赖性细胞毒性（antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC）报告试验评估，发现8株中和抗体具有ADCC活性，且与已知的小鼠IgG亚型趋势一致，其中IgG2a活性最强，IgG2b次之，IgG1最弱。所有非IgG1的中和抗体均表现出ADCC活性，且该活性与表位位置无明显关联。

为确定中和抗体的表位位置，研究通过抗体逃逸突变分析对VSV-ANDV进行连续传代和突变筛选。对每株中和抗体诱导的逃逸突变体进行单克隆挑取和Sanger测序，共鉴定出多个关键氨基酸位点突变。这些突变位点被映射到基于图拉病毒Gn晶体结构（PDB 5FXU）和汉滩病毒Gc晶体结构（PDB 5LJY和5LK3）构建的ANDV Gn和Gc计算模型上。结果显示，来自同源免疫方案的中和抗体大多识别Gn上的表位，而来自异源方案的中和抗体大多识别Gc上的表位。Gn结合抗体的逃逸突变位点如D121、N108、K124、K225等均位于Gn单体外部、远离膜表面的区域；Gc结合抗体的逃逸突变位点如S831、P830、N939、S883、C1129等则分布于Gc融合前和融合后构象的不同区域。通过交叉中和试验的热图分析，12株中和抗体被归为7个不同的表位群，部分抗体之间存在重叠或相互作用的表位，例如KL-AN-4G11与KL-AN-5E8、KL-HAP-2D11与KL-HAP-2F7等。

在体内保护研究中，选取了4株具有不同结合特性和效应功能的抗体——KL-HAP-2D11（结合Gc，无ADCC活性）、KL-AN-4E1（结合Gn，有ADCC活性）、KL-AN-5E8（结合Gn，有ADCC活性）和KL-HAP-6B12（结合Gc，有ADCC活性），在叙利亚仓鼠模型中评估其暴露后治疗效果。仓鼠经鼻内接种200个病灶形成单位（ffu）的ANDV，于感染后第3天和第8天腹腔注射25 mg/kg的单克隆抗体。结果显示，4株抗体治疗组均实现100%存活，而IgG对照抗体治疗组全部死亡，死亡时间为感染后第10至13天。呼吸频率监测显示，仅对照组动物在死亡前1至2天出现呼吸频率显著升高。感染后第10天，KL-AN-5E8和KL-HAP-6B12治疗组仓鼠肺组织中病毒基因组拷贝数较对照组显著降低，而KL-HAP-2D11和KL-AN-4E1治疗组仍有可检出病毒RNA。到第42天，除一只KL-HAP-2D11治疗组仓鼠外，所有治疗组动物肺内均检测不到病毒RNA。这些结果说明4株单克隆抗体均能提供完全的保护效果，且部分抗体还能显著加速病毒清除。

本研究的核心结论是，ANDV GnGc复合物上存在广泛且多样的中和抗体表位，这些表位分布于Gn和Gc的不同结构域，所诱导的抗体在结合特性、中和能力、ADCC活性以及体内保护效果上各有不同。同源免疫策略主要诱导针对Gn的抗体，而异源免疫策略则更倾向于诱导针对Gc的抗体，这可能与Gc的序列保守性较高有关。通过逃逸突变分析和计算结构建模，研究明确了这些抗体的表位分布和结构基础，为深入理解汉坦病毒糖蛋白复合物的抗原性和融合机制提供了工具。更重要的是，4株代表不同表位和功能特征的单克隆抗体在叙利亚仓鼠模型中以单药形式实现了100%的暴露后保护，展示了将单克隆抗体开发为HCPS治疗药物的潜力。此外，这些抗体可望用于设计多表位组合疗法，以提高抗病毒效果并降低逃逸突变风险。该研究还为未来汉坦病毒疫苗设计提供了可选择的抗原表位图谱，并为研究其他新世界汉坦病毒的宿主互作和免疫保护机制提供了参考。