本研究由首都医科大学附属北京天坛医院超声科的Liu Xinyao、Du Yue、Cheng Linggang、He Wen、Zhang Wei以及首都医科大学附属北京同仁医院心血管中心的Liu Jian共同完成。其中He Wen与Zhang Wei为共同通讯作者。该研究成果发表于*Brain Research Bulletin*第193卷（2023年），于2022年12月31日在线发表，DOI为10.1016/j.brainresbull.2022.12.009。该研究得到了中国国家自然科学基金（批准号81730050）的资助。
缺血性卒中（ischemic stroke）是全球范围内导致残疾和死亡的主要原因之一。目前临床上的一线治疗手段是尽快恢复闭塞血管的血供，但由于治疗时间窗狭窄以及缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤的存在，缺血性卒中患者的预后仍然不容乐观。脑I/R损伤涉及多种细胞死亡形式，包括坏死（necrosis）、凋亡（apoptosis）、坏死性凋亡（necroptosis）和自噬（autophagy）等。然而，即便抑制上述细胞死亡形式，也只能部分改善实验性脑I/R损伤的预后，无法有效挽救神经元死亡，这提示可能存在另一种尚未明确的细胞死亡形式参与其中。
铁死亡（ferroptosis）是一种新发现的受调控细胞死亡形式，在形态学、生物化学和遗传学层面均与其他细胞死亡方式截然不同。铁死亡的核心生化特征包括铁过载（iron overload）和脂质过氧化（lipid peroxidation）的积累，其形态学特征表现为线粒体皱缩、线粒体膜密度增高等。谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）和溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）被认为是铁死亡的核心调控因子，二者表达水平的下降通常被视为铁死亡的标志物。
已有研究提示铁死亡与缺血性卒中密切相关，但铁死亡特异性抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）在缺血性卒中中的潜在保护效应及其分子机制尚不清楚。鉴于Akt/GSK3β信号通路对铁死亡的抑制作用已在既往研究中有所报道，本研究旨在探索Fer-1是否通过调控Akt/GSK3β通路在缺血性卒中中发挥抗铁死亡保护作用。
本研究采用了体内和体外两个层面的实验体系，系统性地验证了Fer-1对脑I/R损伤的神经保护效应及其机制。
研究选用8至10周龄、体重20至25克的雄性C57BL/6小鼠，通过线栓法建立短暂性大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。具体操作中，将单丝尼龙线栓从颈外动脉插入颈内动脉并阻断右侧大脑中动脉，闭塞1小时后拔出线栓进行再灌注。假手术（sham）组小鼠接受相同手术但不阻断大脑中动脉。术中通过激光散斑对比成像（laser speckle contrast imaging）监测皮质血流以确保闭塞和再灌注成功。
Fer-1以10 mg/kg的剂量在再灌注后立即通过鼻内给药方式给予小鼠，对照组给予等量溶剂。给药后6小时、24小时和72小时分别进行15分制神经功能缺损评分和平衡木行走测试，以评估神经行为学结果。72小时后处死小鼠，进行以下检测：（1）2,3,5-三苯基四唑氯化物（TTC）染色评估脑梗死体积；（2）Nissl染色评估神经元存活情况；（3）NeuN与TUNEL共染色评估神经元死亡情况；（4）Perls‘ 3,3’-二氨基联苯胺（DAB）染色评估脑组织铁沉积；（5）相应试剂盒检测脑组织中总铁含量、丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平和谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量；（6）透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）观察线粒体超微结构；（7）Western blotting检测GPX4、SLC7A11、磷酸化Akt（p-Akt）、磷酸化GSK3β（p-GSK3β）及对应总蛋白的表达水平。
为验证Akt在Fer-1保护效应中的功能作用，体内实验中部分小鼠在Fer-1给药前预先给予Akt抑制剂MK-2206（100 mg/kg），随后检测上述信号通路蛋白和铁死亡相关蛋白的表达变化。
体外实验采用小鼠海马神经元HT22细胞系，通过氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation，OGD）处理建立细胞I/R模型。细胞在无糖、去氧的DMEM培养基中、含95% N₂和5% CO₂的培养箱中孵育6小时，随后恢复正常培养基在常规条件下培养24小时。对照组细胞正常培养相同时间。
细胞实验流程包括：（1）CCK-8法筛选Fer-1对HT22细胞无毒性的最大浓度（确定为50 μM）；（2）在OGD条件下给予1 μM Fer-1处理，CCK-8法评估细胞活力；（3）光学显微镜观察细胞形态变化；（4）Western blotting检测SLC7A11和GPX4表达；（5）试剂盒检测细胞内总铁和GSH含量；（6）Western blotting检测p-Akt、总Akt、p-GSK3β和总GSK3β的表达。
在机制验证环节，OGD诱导的HT22细胞在Fer-1处理前先用Akt抑制剂MK-2206（2 μM）预处理，再检测信号通路蛋白、铁死亡相关蛋白、细胞活力、铁含量和GSH含量。
统计分析方面，两组间比较采用Student’s t检验，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA）配合Bonferroni事后检验，P<0.05定义为具有统计学显著性。
研究首先验证了铁死亡在脑I/R模型中的存在。Western blotting结果显示，MCAO组GPX4蛋白水平在再灌注72小时时显著降低（图2A）。Perls’染色显示MCAO组脑皮质铁沉积明显增加，与脑组织匀浆中的总铁含量检测结果一致（图2B、C）。脂质过氧化终产物MDA水平在MCAO组显著升高，而总GSH水平显著降低（图2D、E）。透射电镜观察显示，MCAO组线粒体呈现铁死亡的特征性改变——线粒体皱缩、膜密度增高、嵴减少或消失（图2F）。上述结果共同证明脑I/R后铁死亡确实发生，为进一步验证Fer-1的治疗效应奠定了病理基础。
在确认铁死亡参与脑I/R损伤后，研究进一步检验了Fer-1的治疗效果。结果显示，Fer-1给药后能够显著降低MCAO模型中的脑组织铁沉积和总铁含量（图3A、B），同时降低MDA水平（图3C），恢复I/R诱导的GSH含量下降以及SLC7A11和GPX4蛋白表达降低（图3D、E）。透射电镜观察证实，Fer-1处理可阻止铁死亡特征性的线粒体形态改变（图3F）。这些结果从铁代谢、脂质过氧化和形态学多个维度证实了Fer-1对脑I/R后铁死亡的有效抑制。
在功能性结局方面，Fer-1治疗组的梗死体积较MCAO组显著缩小（图4A），神经功能评分在给药后24小时和72小时均显著改善（图4B），平衡木测试评分亦明显提高（图4C）。Nissl染色和NeuN/TUNEL共染色均显示Fer-1能够显著减少神经元丢失和死亡（图4D、E）。这些结果共同表明Fer-1通过抑制铁死亡有效缓解了I/R诱导的脑损伤。
为探究Fer-1发挥保护效应的分子通路，研究检测了Akt/GSK3β信号通路的激活状态。Western blotting结果显示，MCAO组中p-Akt和p-GSK3β的表达水平显著降低，而Fer-1给药后能够有效恢复二者的磷酸化水平（图5）。这一发现提示Fer-1的神经保护效应可能与Akt/GSK3β信号通路的激活密切相关。
体外实验结果与体内实验高度一致。CCK-8实验显示OGD显著降低HT22细胞活力，而1 μM Fer-1处理可显著改善细胞存活率（图6B）。形态学观察也直观证实了这一保护效应（图6C）。在分子水平上，OGD组SLC7A11和GPX4表达显著下调，Fer-1处理则恢复其表达（图6D）。Fer-1同时降低了细胞内铁含量并升高了GSH水平（图6E、F）。更为关键的是，Fer-1同样能够在体外增强Akt和GSK3β的磷酸化水平（图6G），与体内实验结果相互印证。
为确定Akt激活是否为Fer-1保护效应的必需环节，研究在体外和体内分别使用Akt抑制剂MK-2206进行功能阻断实验。在HT22细胞中，MK-2206预处理有效阻断了Fer-1对Akt和GSK3β磷酸化的促进作用，同时也取消了Fer-1对SLC7A11和GPX4表达的上调效应（图7A）。功能上，MK-2206阻断了Fer-1改善细胞活力、降低铁含量和升高GSH含量的作用（图7B-D）。在体内MCAO模型中，MK-2206同样显著降低了p-Akt、p-GSK3β、SLC7A11和GPX4的表达水平（图8），进一步证实了Akt在Fer-1介导的神经保护效应中扮演关键角色。
本研究系统性地证明了铁死亡在脑I/R损伤中的重要作用，并首次阐明了Fer-1通过激活Akt/GSK3β信号通路发挥神经保护效应的分子机制。研究结果表明，Fer-1能够通过恢复SLC7A11和GPX4的表达、降低铁蓄积和脂质过氧化水平来抑制铁死亡，进而减小脑梗死体积、改善神经功能预后。
本研究的科学价值在于：第一，为铁死亡作为缺血性卒中治疗新靶点提供了扎实的实验证据；第二，首次建立了Fer-1与Akt/GSK3β信号通路之间的功能关联，拓展了对铁死亡调控机制的认知；第三，从体内和体外两个层面相互验证，增强了结论的可靠性。
在应用价值方面，Fer-1作为一种铁死亡特异性抑制剂，有望发展为缺血性卒中的潜在临床治疗药物。对于目前治疗时间窗有限、再灌注损伤难以有效控制的临床困境而言，靶向铁死亡的干预策略可能提供一种全新的治疗思路。
本研究的主要亮点包括：首先，系统性地在脑I/R模型中从铁代谢、脂质过氧化、抗氧化系统和线粒体形态学等多个维度完整验证了铁死亡的发生及其可干预性；其次，该研究首次揭示Fer-1的神经保护作用依赖于Akt/GSK3β信号通路的激活，这一发现填补了铁死亡抑制剂在缺血性卒中中分子机制研究的空白；再次，研究采用了体内和体外相结合、药理学阻断与分子检测相配合的实验策略，逻辑链完整、证据层级清晰。
值得注意的是，作者在讨论部分指出，Fer-1降低铁含量的机制可能与铁代谢相关蛋白——铁输出蛋白ferroportin（FPN）和转铁蛋白受体1（transferrin receptor 1，TFR1）的调控有关，这一推测为后续深入研究Fer-1调控铁代谢的具体分子路径提供了方向。此外，作者也坦诚指出Fer-1是否能够直接激活Akt仍是未来需要探索的问题。该研究的数据可在合理请求下获取，补充材料可在期刊网站上查阅。