藤黄酸靶向HSP90通过抑制肠上皮细胞坏死性凋亡缓解DSS诱导的结肠炎：一项原创性研究报告
一、 研究作者、机构与发表信息
本研究由Yuanyuan Wang, Siqi Liu, Keyi Lu, Erping Xu*, Zhibin Wang* 合作完成。主要研究机构包括：1) 河南省中医药大学河南省豫药全产业链研发创新协同中心及中医药科学院；2) 海军军医大学麻醉学院重症医学科。该研究作为原创性研究论文（Original Research）发表于Frontiers in Pharmacology 期刊，于2025年5月19日在线发表，文章引用编号为：Wang Y, Liu S, Lu K, Xu E and Wang Z (2025) Gambogic acid targets HSP90 to alleviate DSS-induced colitis via inhibiting the necroptosis of intestinal epithelial cells. Front. Pharmacol. 16:1586705. doi: 10.3389/fphar.2025.1586705。
二、 学术背景与研究目的
本研究隶属于药理学、胃肠病学及中药现代化研究交叉领域，聚焦于溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis, UC）的新型治疗策略开发。溃疡性结肠炎是一种慢性、特发性肠道炎症性疾病，全球发病率不断上升，被世界卫生组织列为“现代难治性疾病”。现有药物如氨基水杨酸类、皮质类固醇和免疫抑制剂存在耐药性高、不良反应多、肿瘤风险增加等挑战，亟需开发新的有效药物。
研究背景基于以下关键科学认知：1) 肠上皮细胞（Intestinal Epithelial Cells, IECs）的异常死亡是导致肠道屏障破坏和炎症加剧的核心环节。2) 坏死性凋亡（Necroptosis）是一种促炎性的程序性细胞死亡方式，在UC病理过程中扮演关键角色。临床数据显示，IBD患者炎症组织中坏死性凋亡关键蛋白RIPK3和MLKL水平升高。抑制坏死性凋亡可减轻肠道屏障损伤和炎症。3) 热休克蛋白90（Heat Shock Protein 90, HSP90）已被鉴定为调控坏死性凋亡信号通路关键蛋白（RIPK1, RIPK3, MLKL）稳定性和功能的重要分子伴侣。4) 在中医理论中，IECs的坏死性凋亡导致肠道屏障破坏的过程与“热毒”病机相似，清热解毒类中药可能具有干预潜力。
基于此，研究团队从具有清热解毒、消肿功效的中药化合物库中筛选出藤黄（Garcinia hanburyi Hook. f.）的主要活性成分——藤黄酸（Gambogic Acid, GA）。然而，GA在UC中的作用和机制此前未有报道。因此，本研究旨在：探究GA对葡聚糖硫酸钠（Dextran Sulfate Sodium, DSS）诱导的小鼠结肠炎是否具有保护作用，并阐明其是否通过靶向HSP90、抑制IECs坏死性凋亡来发挥作用的分子机制。
三、 详细研究流程与方法
本研究采用了系统的、多层次的研究策略，从体外细胞模型到体内动物模型，并结合生物信息学、分子对接与动力学模拟进行机制探索。主要流程如下：
1. 体外研究：GA抗坏死性凋亡活性鉴定与初步机制探索 * 研究对象与处理：使用人结肠腺癌细胞系HT-29。建立TNF-α、SM-164和Z-VAD-FMK（TSZ）联合诱导的坏死性凋亡模型。 * 实验方法： * 细胞活力测定：用不同浓度GA（0.08-5 μM）预处理细胞后，用TSZ诱导坏死性凋亡，使用CellTiter-Lumi II发光法检测细胞活力，计算EC50。 * 活/死细胞双染：使用Calcein-AM/PI染色试剂盒，荧光显微镜下观察活细胞（绿色）和死细胞（红色）。 * Western Blot分析：检测GA对坏死性凋亡通路关键蛋白磷酸化水平的影响。分别设置了不同浓度GA处理6小时，以及固定浓度GA（5 μM）预处理后不同时间点TSZ刺激的实验组，分析p-RIPK1、p-RIPK3、p-MLKL的表达。 * 激酶活性检测（KinomeScan™分析）：为明确GA是否直接抑制RIPK1、RIPK3或MLKL的激酶活性，委托DiscoverX公司使用KinomeScan™技术测定GA与这些激酶的亲和力（Kd值）。这是一种基于竞争结合和定量PCR检测的高通量激酶结合谱分析技术。
2. 体内研究：GA对DSS诱导的小鼠UC模型的治疗作用评估 * 动物模型与分组：使用6-7周龄雄性C57BL/6J小鼠，随机分为：对照组（CON）、DSS模型组、GA高剂量组（5 mg/kg，灌胃）、GA低剂量组（0.5 mg/kg，灌胃）、阳性药Nec-1组（5 mg/kg，腹腔注射）。每组6只。CON组正常饮水，其余组饮用3% DSS水7天诱导结肠炎，随后停止DSS，开始给予相应药物或溶剂治疗7天。 * 疗效评价指标与方法： * 疾病活动指数（Disease Activity Index, DAI）：每日评估体重下降、便血、腹泻严重程度并计分。 * 结肠宏观形态：实验结束测量结肠长度。 * 肠道通透性：通过口服FITC-葡聚糖（FD4）后检测血清中荧光强度来评估。 * 组织病理学：结肠组织进行H&E染色评估炎症和损伤；PAS染色评估杯状细胞数量。 * 血清炎症因子：ELISA法检测血清TNF-α水平。 * 肠道屏障功能相关蛋白检测：免疫荧光和Western Blot检测结肠组织中紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达与分布；免疫荧光检测粘蛋白MUC-2的表达。 * 坏死性凋亡通路检测：Western Blot检测结肠组织中p-RIPK1、p-RIPK3、p-MLKL蛋白水平；免疫荧光检测p-RIPK3和p-MLKL在肠绒毛IECs中的定位与表达。 * HSP90抑制效应验证：Western Blot和免疫荧光检测结肠组织中HSP90及其抑制的生物标志物HSP70的表达水平。 * 安全性评估：检测血清ALT、AST、BUN、Cre水平，并对心、肝、肾组织进行H&E染色，评估GA在有效剂量下的毒性。
3. 生物信息学与计算模拟：GA作用靶点预测与验证 * 网络药理学分析：从GeneCards数据库获取与UC、坏死性凋亡以及GA相关的潜在靶点基因。取三者的交集基因，利用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并通过Cytoscape软件进行拓扑分析，根据度值（Degree）筛选核心靶点。 * 分子对接（Molecular Docking）：从PDB数据库获取HSP90α蛋白结构（ID: 8AGL），从NCBI PubChem获取GA的三维结构。使用AutoDock Vina软件模拟GA与HSP90α的结合模式，并用Maestro软件可视化。 * 分子动力学模拟（Molecular Dynamics Simulation）：基于对接结果，使用Desmond程序对GA-HSP90α复合物进行100纳秒的分子动力学模拟。分析均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）以及配体-蛋白质相互作用，评估复合物在模拟环境下的稳定性及关键相互作用残基。
4. 机制验证实验：GA通过HSP90抑制坏死性凋亡通路的验证 * 协同作用实验：在HT-29细胞坏死性凋亡模型中，将GA与已知的坏死性凋亡抑制剂（Nec-1: RIPK1抑制剂；TAK632: RIPK1/3抑制剂；NSA: MLKL抑制剂）联合使用，检测细胞活力，观察是否存在协同效应，以间接推断GA的作用靶点可能位于这些激酶的上游。 * HSP90活性检测：在HT-29细胞中，通过Western Blot检测GA处理后，HSP90的客户蛋白EGFR（表皮生长因子受体）和HSP90抑制的经典标志物HSP70的表达变化。HSP90被抑制会导致其客户蛋白降解（如EGFR下调）并诱导HSP70补偿性上调。
5. 数据分析：所有数据以均值±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），随后进行Tukey多重比较检验。P < 0.05被认为具有统计学显著性。
四、 主要研究结果及其逻辑关系
1. GA被鉴定为有效的坏死性凋亡抑制剂。 在TSZ诱导的HT-29细胞坏死性凋亡模型中，GA处理显著提高了细胞存活率（EC50 = 1.48 μM），Calcein-AM/PI双染显示死亡细胞（红色）减少。Western Blot结果显示，GA以剂量和时间依赖性的方式显著抑制了TSZ诱导的RIPK1、RIPK3和MLKL的磷酸化。此结果首次证明了GA在体外具有抑制肠上皮细胞坏死性凋亡的活性，为后续体内研究奠定了基础。
2. GA显著缓解DSS诱导的小鼠UC损伤。 与DSS模型组相比，GA（5 mg/kg）治疗显著改善了UC症状：小鼠体重下降得到恢复，DAI评分降低，便血和腹泻改善，结肠长度缩短得到抑制（提示炎症水肿减轻），血清FITC-葡聚糖荧光强度降低（表明肠道通透性改善）。H&E染色显示GA减少了结肠黏膜下层水肿和炎性细胞浸润。其疗效与阳性药Nec-1相当。这些结果证实了GA在体内对结肠炎具有明确的保护作用。
3. GA改善UC小鼠的肠道炎症和屏障功能。 GA治疗显著降低了UC小鼠血清中的促炎因子TNF-α水平。免疫荧光和Western Blot结果显示，GA能上调结肠组织中紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达，并促进其正常分布。PAS染色和MUC-2免疫荧光显示，GA增加了结肠杯状细胞数量和粘蛋白MUC-2的表达。这些数据表明，GA不仅能减轻炎症，还能修复被破坏的肠道机械屏障和化学屏障。
4. GA抑制UC小鼠肠绒毛IECs的坏死性凋亡。 Western Blot分析显示，GA治疗显著降低了结肠组织中p-RIPK1、p-RIPK3和p-MLKL的蛋白水平。免疫荧光进一步证实，p-RIPK3和p-MLKL在肠绒毛IECs中的表达和定位在GA治疗后减少。此结果将体外的发现延伸至体内，证明GA在疾病模型中确实能够抑制IECs的坏死性凋亡，这可能是其修复肠道屏障、减轻炎症的核心机制之一。
5. GA不直接抑制RIPK1/3/MLKL激酶活性。 KinomeScan™分析结果显示，GA在测试浓度下对RIPK1、RIPK3和MLKL的配体结合没有抑制作用（Kd > 10 μM），表明GA并非通过直接抑制这些激酶的催化活性来阻断坏死性凋亡。这一关键发现促使研究者寻找其上游作用靶点。
6. 生物信息学预测HSP90为GA作用的核心靶点。 网络药理学分析交集得到45个GA、UC和坏死性凋亡的共同靶点基因。PPI网络分析显示，HSP90AA1（编码HSP90α）是连接度最高的核心节点。分子对接模拟表明，GA能够与HSP90的ATP结合口袋结合，与Lys58、Asp102、Asn106等关键氨基酸形成氢键。100 ns的分子动力学模拟显示，GA-HSP90复合物结构稳定，相互作用持久。计算模拟为GA靶向HSP90提供了强有力的理论预测。
7. 实验验证GA通过靶向抑制HSP90来抑制坏死性凋亡通路。 * 协同作用：GA与Nec-1、TAK632、NSA等坏死性凋亡抑制剂联用显示出协同效应，提示GA的作用靶点位于这些已知抑制剂的上游或不同通路。 * HSP90抑制标志物变化：在HT-29细胞中，GA处理以剂量和时间依赖性的方式下调了HSP90客户蛋白EGFR的表达，同时上调了HSP70的表达，这是HSP90功能被抑制的经典药效学标志。 * 体内验证：在UC小鼠结肠组织中，GA治疗同样导致HSP90蛋白表达下调，而HSP70表达上调。 * 机制关联：综合以上，研究提出GA通过抑制HSP90，破坏了HSP90对RIPK1、RIPK3、MLKL等坏死性凋亡关键蛋白的稳定和调控作用，从而导致这些蛋白（尤其是其磷酸化形式）降解或失活，最终抑制了IECs的坏死性凋亡。
8. GA在有效治疗剂量下未表现出心、肝、肾毒性。 在5 mg/kg的有效剂量下，GA治疗未引起UC小鼠血清ALT、AST、BUN、Cre水平的显著变化，心、肝、肾组织病理切片也未观察到明显损伤。这表明在该研究剂量下，GA具有较好的安全性。
五、 研究结论与价值
本研究得出明确结论：藤黄酸（GA）能够通过靶向抑制热休克蛋白90（HSP90），进而抑制肠上皮细胞（IECs）中坏死性凋亡关键蛋白RIPK1、RIPK3和MLKL的磷酸化与激活，从而缓解DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎（UC）。其作用包括减轻肠道炎症、修复肠道屏障功能（增加紧密连接蛋白和粘蛋白表达）、并最终改善疾病症状。
科学价值： 1. 揭示了GA治疗UC的新机制：首次系统阐明了GA通过“HSP90-坏死性凋亡”轴发挥肠道保护作用的分子通路，为理解GA的抗炎和细胞保护作用提供了新视角。 2. 验证了HSP90作为UC治疗新靶点的潜力：研究不仅证实了GA通过抑制HSP90起作用，也间接支持了靶向HSP90以调控坏死性凋亡、治疗UC这一策略的可行性。 3. 为中药现代化研究提供范例：成功运用“中医理论指导（清热解毒）-活性成分筛选-多维度机制验证（计算模拟、体外、体内）”的研究模式，将传统中药功效与现代疾病病理机制（坏死性凋亡）和分子靶点（HSP90）紧密结合，推动了中药活性成分的深度药理机制阐释。
应用价值： 1. 为新药研发提供先导化合物：GA作为一种天然产物，显示出治疗UC的良好疗效和初步的安全性，有望被开发成为治疗UC，尤其是与坏死性凋亡相关的肠道疾病的新型药物或药物前体。 2. 拓展了HSP90抑制剂的适应症：为HSP90抑制剂的应用开辟了炎症性肠病这一新的疾病领域。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
研究在讨论部分对比了目前处于临床研究阶段的坏死性凋亡抑制剂（如Nec-1衍生物GSK2982772、SAR443060）的局限性与挑战（如代谢稳定性差、疗效有限、长期毒性等），从而凸显了从天然产物中寻找高效低毒坏死性凋亡抑制剂的优势和价值。此外，作者也客观指出，坏死性凋亡还存在其他调控通路（如NF-κB、MAPK），GA可能还存在其他未被发现的靶点，这为未来更深入的研究指明了方向。研究最终提出了一个清晰的作用机制示意图（Figure 11），概括了GA通过抑制HSP90，破坏其对坏死性凋亡信号复合体的支持，从而抑制IECs坏死性凋亡、保护肠道屏障、缓解结肠炎的完整通路。