一、研究背景与目的
Zika病毒（ZIKV）是一种严重的人类病原体，尽管其在2014年法属波利尼西亚和2015年巴西的暴发导致了格林-巴利综合征和小头症等严重神经病理后果，但目前尚无获批的抗病毒药物或疫苗。在抗ZIKV药物研发中，两个关键的病毒蛋白成为靶点：ZIKV蛋白酶（NS2B-NS3蛋白酶）和RNA依赖性RNA聚合酶（NS5 RdRp）。前者负责切割病毒多聚蛋白为功能性蛋白，后者负责合成双链RNA。已有的蛋白酶抑制剂如杨梅素、姜黄素和pedalitin的IC50值在1.3至5 µM之间；而RdRp的抑制剂多为核苷类似物（NIs），非核苷抑制剂（NNIs）因对病毒靶标的选择性更高且副作用更少而更具治疗优势，但针对ZIKV RdRp的NNI仅有TBP化合物一种（IC50为94 nM）。
查尔酮（chalcones），又称苄基苯乙酮，是开放链黄酮类化合物，由两个芳香环通过α,β-不饱和羰基系统连接。药用植物明日叶（Angelica keiskei Koidzumi，又称Ashitaba）可产生超过20种查尔酮，这些化合物具有抗菌、抗病毒活性，并能抑制哺乳动物和微生物蛋白，包括流感病毒神经氨酸酶和SARS-CoV的两种蛋白酶。基于此，研究者假设查尔酮可能抑制ZIKV的关键蛋白并阻断病毒复制。
二、研究设计与方法流程
本研究由巴西戈亚斯联邦大学（Universidade Federal de Goiás）的Carolina H. Andrade团队和美国北卡罗来纳州立大学（North Carolina State University）的Scott M. Laster团队联合开展，合作单位还包括北卡罗来纳大学格林斯伯勒分校（University of North Carolina Greensboro）、圣保罗大学（University of São Paulo）等。研究成果发表于 *Bioorganic Chemistry*（2022年，第120卷，文章号105649），于2022年1月31日在线发表。
1. 查尔酮的分离与纯化
研究者从新鲜明日叶根中提取材料，经干燥、研磨后，用甲醇浸泡提取，再通过液-液分配（正己烷脱脂、乙酸乙酯/甲醇/水分配）获得粗提物。采用正相闪柱色谱（硅胶柱，己烷/氯仿/甲醇梯度）和反相制备型高效液相色谱（HPLC），最终纯化出三种查尔酮：4-羟基德里辛（4-hydroxyderricin，4-HD）、黄当归醇（xanthoangelol，XA）和黄当归醇-E（xanthoangelol-E，XA-E）。通过高分辨质谱（HRESIMS）和核磁共振（NMR）确认结构，纯度均达95%以上。三种化合物均具有共同的二羟基查尔酮核心骨架，XA是唯一含有间苯二酚环的，4-HD和XA-E含有苄基-1-醇-3-甲氧基；4-HD和XA分别具有异戊烯基和香叶基脂肪链，而XA-E在相同位置具有极性过氧化物基团。
2. 分子对接研究
研究首先通过OpenZika项目（与IBM世界社区网格合作的开放科学项目）使用AutoDock Vina软件进行分子对接。针对NS2B-NS3蛋白酶，分别使用催化位点（PDB ID: 5YOD，闭合构象）和变构位点（PDB ID: 5GXJ，开放构象）的晶体结构建立对接网格。针对NS5 RdRp，使用其晶体结构（PDB ID: 5TFR）的变构位点（n-pocket）进行对接。结果表明，三种查尔酮与蛋白酶变构位点和催化位点的对接分数为-6.5至-8.0 kcal·mol⁻¹，与RdRp的对接分数为-3.1至-4.4 kcal·mol⁻¹。可视化分析显示，在蛋白酶变构位点，三种查尔酮均能与关键残基天冬酰胺152（Asn152）形成氢键；在催化位点，仅4-HD能与催化三联体中的His51形成疏水相互作用。
由于XA对RdRp的对接分数较低与其酶学实验结果不一致，研究者进一步进行了集合对接（ensemble docking）。通过500 ns的分子动力学（MD）模拟获得RdRp的不同构象，将轨迹聚类为16个簇，其中簇7和簇15的引物环呈开放构象。同时，基于DENV3 RdRp（PDB ID: 5JJS）构建了ZIKV NS5 RdRp的开放构象同源模型。使用AutoDock Vina进行200次重复对接，并用随机森林打分函数（RFScore-V3）重新评分。结果显示，XA的最佳对接姿势（Vina分数-9.0 kcal·mol⁻¹）与引物环及n-pocket残基（Lys802、Trp805、Leu513、Arg739、Glu804、Thr796、Tyr768）形成多种相互作用，这些相互作用在闭合构象的晶体结构对接中未能观察到。
3. 机器学习预测
研究者使用Assay Central™软件构建了贝叶斯机器学习模型，预测查尔酮的抗ZIKV活性和细胞毒性。模型基于从文献和公共数据库（PubChem、ChEMBL）整理的ZIKV数据集，以及Vero细胞毒性数据集。所有模型均通过5折交叉验证。预测结果显示，三种查尔酮均被预测为具有抗ZIKV活性，其中XA的预测活性评分高于4-HD和XA-E。
4. 酶学活性测定
蛋白酶抑制实验：将NS2B-NS3蛋白酶基因（GenBank登录号KU321639.1）克隆至pETSUMO-1a/LIC载体，在E. coli Rosetta (DE3)中表达，经Ni亲和层析和凝胶过滤纯化。采用荧光底物Bz-NKRR-AMC进行活性测定。首先在200 µM浓度进行单点筛选，三种查尔酮均抑制超过80%的蛋白酶活性。随后进行浓度-反应实验，测得4-HD、XA和XA-E的IC50值分别为47 ± 10 µM、50 ± 5 µM和18 ± 5 µM。动力学分析（Michaelis-Menten和Lineweaver-Burk图）显示，随着查尔酮浓度增加，Vmax降低而Km保持不变，表明其为非竞争性（变构）抑制模式。阳性对照抑肽酶（aprotinin）的IC50为0.13 ± 0.02 µM。
RdRp抑制实验：将NS5 RdRp基因克隆至pETTRX-1a/LIC载体，在*E. coli*中表达纯化。采用基于SYBR Green I荧光染料的新型实时荧光检测方法，以poly-U为RNA模板、ATP为底物进行聚合酶活性测定。在20 µM终点实验中，仅XA抑制了85%的聚合酶活性（超过80%阈值），而4-HD和XA-E无显著抑制作用。浓度-反应实验测得XA的IC50为6.9 ± 0.9 µM。
5. 体外抗病毒实验
在Vero细胞（ATCC CCL-81）中进行抗病毒活性测定。以感染复数（MOI）为1的ZIKV（ATCC株MR-766）感染细胞1小时，然后加入不同浓度的查尔酮，48小时后收集上清液，通过噬斑实验测定病毒滴度。同时，使用乳酸脱氢酶（LDH）释放法测定化合物对Vero细胞的细胞毒性。结果显示：4-HD和XA-E具有显著的抗ZIKV活性，EC50值分别为6.6 µM和22.0 µM，分别在45 µM和75 µM时完全阻断病毒复制；XA即使浓度超过50 µM也只显示弱抑制活性，无法计算EC50。细胞毒性方面，4-HD和XA-E的CC50分别为103 ± 14 µM和111 ± 10 µM，对应的选择指数（SI）分别为17和5。XA未显示明显细胞毒性。
三、主要结果与数据分析
1. 分子对接与酶学实验的验证关系
分子对接预测了查尔酮与蛋白酶变构位点的结合，酶学实验证实了三种查尔酮均能抑制蛋白酶活性，且动力学分析表明其为非竞争性抑制，验证了变构位点结合的预测。对于RdRp，初始对接分数较差，但集合对接（考虑引物环开放构象）揭示了XA更优的结合模式，这与XA在酶学实验中表现出的RdRp抑制活性（IC50 = 6.9 µM）相吻合。值得注意的是，XA的最佳对接姿势与DENV RdRp变构抑制剂化合物27在n-pocket中的结合模式具有高度相似性，两者利用共同的配体基团（羟基、离域π电子、含羟基/甲氧基的芳香环）与口袋的相似区域相互作用。
2. 结构-活性关系分析
三种查尔酮的结构差异导致其活性差异：XA-E在蛋白酶抑制中活性最强（IC50 = 18 µM），可能因其极性过氧化物基团增强了与变构位点周围残基（Lys73、Leu76、Trp83等）的相互作用；XA在RdRp抑制中表现出独特活性，推测其脂肪族香叶基链通过与RdRp残基的疏水接触发挥关键作用；4-HD和XA-E表现出良好的全细胞抗病毒活性，而XA虽具有酶学抑制活性但抗病毒活性弱，研究者推测XA的脂肪族侧链可能导致其大量插入细胞膜而无法以足够浓度到达细胞内靶标位置。
3. 研究结论
本研究表明，从明日叶中分离的查尔酮4-HD、XA和XA-E能够抑制ZIKV的关键复制蛋白。酶学实验证实了查尔酮对NS2B-NS3蛋白酶变构位点的非竞争性抑制（IC50为18-50 µM），其中XA-E活性最强；XA还能抑制NS5 RdRp的变构位点（IC50为6.9 µM）。全细胞实验显示4-HD和XA-E具有抗ZIKV活性（EC50分别为6.6和22.0 µM），且细胞毒性较低（选择指数分别为17和5）。查尔酮因其简单的结构和易于修饰的特点，是抗ZIKV药物先导化合物优化的有吸引力的候选分子。
四、研究价值与意义
本研究的科学价值在于：首次系统评估了明日叶查尔酮对ZIKV两种关键酶（蛋白酶和聚合酶）的抑制活性，并通过综合运用分子对接、集合对接、机器学习预测、酶学动力学分析和细胞水平抗病毒实验等多种方法，建立了从计算预测到实验验证的完整研究范式。研究还揭示了查尔酮的变构抑制机制，为理解查尔酮类化合物的抗病毒作用提供了新的见解。应用价值方面：4-HD和XA-E具有中等的抗病毒活性和较低的细胞毒性，可作为先导化合物进行进一步的结构优化；XA对RdRp的选择性抑制为开发新型非核苷类RdRp抑制剂提供了新的化学骨架；查尔酮结构的易于修饰特性为构效关系研究提供了广阔空间。
五、研究亮点
多维度研究策略：整合了计算生物学（分子对接、集合对接、MD模拟、机器学习）、生物化学（酶学动力学）和病毒学（细胞感染模型）等多学科方法，实现了从虚拟筛选到实验验证的完整药物发现流程。
集合对接的创新应用：针对RdRp引物环构象变化影响配体结合的问题，通过长时间分子动力学模拟获得不同蛋白构象，结合同源建模构建开放构象模型，显著提高了对接预测的准确性。
发现新型变构抑制剂：首次证明查尔酮可作为ZIKV蛋白酶和聚合酶的变构抑制剂，特别是XA对RdRp的抑制作用为开发新型NNI提供了新的化学起点。
结构-活性关系揭示：鉴定了不同查尔酮亚型（不同侧链修饰）对靶标选择性和细胞活性的影响，为后续结构优化指明了方向。