本研究的主要作者为Xiaobing Lan（蓝小兵）和Qing Wang（王庆），他们作为共同第一作者贡献了同等的工作。其他重要作者包括Yue Liu（刘玥）、Qing You（游青）、Wei Wei（魏玮）、Chunhao Zhu（祝春浩）、Dongmei Hai（海冬梅）、Zhenyu Cai（蔡振宇）等。通讯作者为Jianqiang Yu（余建强）、Jian Zhang（张健）和Ning Liu（刘宁）。研究团队来自多个中国机构，包括作为主要完成单位的宁夏医科大学教育部六盘山地区药用资源保护与开发利用重点实验室、肽与蛋白质药物研究中心、药学院（位于银川），以及西安医学院的陕西省脑疾病与基础及转化医学研究所，上海交通大学医学院的医药化学与生物信息中心，宁夏医科大学宁夏特色中药现代化工程技术研究中心。这项原创性研究成果于2024年10月在线发表在学术期刊《Redox Biology》上，论文题为“Isoliquiritigenin alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury by reducing oxidative stress and ameliorating mitochondrial dysfunction via activating the Nrf2 pathway”。

此项研究的学术背景聚焦于神经科学、药理学和缺血性卒中（Ischemic Stroke）的病理生理机制领域。缺血性卒中是一种由脑动脉阻塞或狭窄引起的常见脑血管疾病，可导致神经元损伤和不可逆的神经功能障碍，是全球成人致残和死亡的主要原因之一。目前，机械取栓和静脉溶栓是主要的临床治疗策略，但存在治疗时间窗狭窄和出血风险等局限。更为严峻的是，当血流恢复至缺血脑组织时，会发生脑缺血再灌注损伤，这反而会加重脑损伤，其病理机制涉及能量代谢紊乱、谷氨酸兴奋性毒性、线粒体功能障碍、氧化应激和细胞凋亡等多个复杂过程。其中，过度的氧化应激和线粒体功能障碍被认为是核心环节。核因子E2相关因子2信号通路是细胞应对氧化应激和线粒体功能障碍的关键防御机制。异甘草素（Isoliquiritigenin, ISL）是从药食同源植物甘草中提取的黄酮类化合物，前期研究报道其具有抗炎、抗氧化、抗凋亡和线粒体保护等多种药理活性，并在大鼠脑缺血模型中显示出初步的神经保护作用，但其确切的分子机制尚不明确。因此，本研究旨在进一步探究ISL对小鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用，并阐明其是否通过激活Nrf2通路来减轻氧化应激和改善线粒体功能障碍，从而发挥保护作用。

详细的研究工作流程系统而严谨，涵盖了体内和体外两个层面，并整合了分子机制探索。整个研究可分为六个主要流程。流程一：动物模型的建立与在体药效学评估。 研究使用雄性ICR小鼠，通过左侧大脑中动脉闭塞（Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO）2小时再灌注24小时的方法建立脑缺血再灌注损伤模型。动物被随机分为多个组别：假手术组、MCAO模型组、ISL低（5 mg/kg）、中（10 mg/kg）、高（20 mg/kg）剂量治疗组、ISL（20 mg/kg）联合Nrf2抑制剂（Brusatol， 1 mg/kg）组，以及阳性对照药尼莫地平组。所有药物在MCAO手术前连续灌胃预处理7天。药效评估指标包括：1) 通过2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色和ImageJ软件分析计算脑梗死体积；2) 使用激光散斑血流成像系统监测大脑皮层相对血流量变化；3) 采用5分制法进行神经功能缺损评分；4) 通过苏木精-伊红染色和尼氏染色观察大脑皮层、海马CA1和CA3区的组织病理学变化，评估神经元形态和尼氏体数量。流程二：体外细胞模型的建立与细胞层面保护作用验证。 研究使用大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞系，通过氧糖剥夺处理模拟体内缺血缺氧条件，建立体外损伤模型。细胞分为对照组、氧糖剥夺模型组、不同浓度ISL（2, 4, 6 μM）治疗组、以及ISL联合Brusatol组。评估指标包括：1) CCK-8法检测细胞活力；2) 试剂盒检测Na+-K+-ATP酶和线粒体超氧化物歧化酶的活性；3) 采用碱性彗星实验，通过CASP软件分析彗星尾部面积、尾长、尾部DNA百分比、尾矩和橄榄尾矩等参数，定量评估DNA损伤程度。流程三：基于蛋白质组学的作用机制初步探索。 为了无偏倚地探索ISL的作用机制，研究者对假手术组、MCAO模型组和ISL治疗组小鼠的缺血侧脑组织进行了数据非依赖性采集定量蛋白质组学分析。利用Thermo Scientific Q Exactive HF-X质谱系统进行检测，使用DIA-NN软件进行蛋白质鉴定和定量。通过生物信息学分析，包括基因本体富集分析、KEGG通路富集分析和蛋白质互作网络分析，筛选出ISL调控的关键差异表达蛋白和信号通路。流程四：氧化应激与线粒体功能的深入检测。 基于蛋白质组学提示的线索，研究在PC12细胞层面深入检测了氧化应激和线粒体功能相关指标：1) 使用Fluo-3 AM荧光探针检测细胞内Ca2+浓度；2) 使用MitoSOX Red荧光探针检测线粒体活性氧水平；3) 使用四甲基罗丹明乙酯探针检测线粒体膜电位；4) 使用Calcein AM探针检测线粒体通透性转换孔的开放程度；5) 通过免疫荧光染色观察凋亡诱导因子的表达和核转位情况。流程五：Nrf2信号通路及线粒体稳态相关蛋白的分子机制验证。 此部分结合体内外实验，从多个角度验证核心机制：1) 体内验证：通过免疫荧光染色观察小鼠脑组织皮层、海马CA1和CA3区神经元中Nrf2的核转位情况；通过蛋白质印迹法检测脑组织中Nrf2及其下游抗氧化蛋白HO-1、NQO1的表达；检测线粒体生物合成、线粒体动力学和线粒体自噬相关蛋白的表达，包括PGC-1α、NRF1、TFAM、DRP1、FIS1、OPA1、MFN2、PINK1、Parkin、p62和LC3等。2) 体外验证：通过免疫共沉淀实验检测PC12细胞中Keap1/Nrf2复合物的结合情况；通过细胞免疫荧光和核质分离蛋白质印迹法观察Nrf2的核转位；通过凝胶迁移或电泳迁移率实验检测Nrf2与抗氧化反应元件的结合活性；通过分子对接技术（使用Schrodinger Maestro软件），以Keap1蛋白的晶体结构为靶点，模拟分析ISL与Keap1 Kelch结构域的结合模式和作用力。流程六：神经元凋亡的最终评估。 在明确ISL改善线粒体功能和激活Nrf2通路的基础上，最后评估其抗凋亡效应：1) 通过TUNEL/NeuN双重免疫荧光染色，定量分析小鼠脑组织皮层、海马CA1和CA3区的神经元凋亡情况；2) 通过免疫荧光染色观察细胞色素C在神经元中的表达；3) 通过蛋白质印迹法检测脑组织中凋亡相关蛋白（细胞色素C、凋亡诱导因子、Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3）的表达水平，并计算Bax/Bcl-2比值。

研究取得了一系列系统性的重要结果。在药效学层面，体内实验结果显示，ISL预处理能剂量依赖性地显著减小MCAO小鼠的脑梗死体积，其中20 mg/kg剂量的效果最佳，与阳性药尼莫地平相当；同时能显著改善缺血区脑血流量，降低神经功能缺损评分，并减轻皮层和海马区的神经元丢失、排列紊乱及尼氏体减少等组织病理损伤。体外实验证实，ISL能剂量依赖性地提高经氧糖剥夺处理的PC12细胞活力，提升Na+-K+-ATP酶和线粒体超氧化物歧化酶的活性，并显著减轻DNA损伤程度。这些结果共同证明了ISL在体内外模型中对脑缺血再灌注损伤均具有明确的神经保护作用。蛋白质组学分析揭示了潜在的作用机制。与假手术组相比，MCAO模型组有770个蛋白质表达发生显著改变；而与模型组相比，ISL治疗组有218个差异表达蛋白。KEGG富集分析表明，ISL调控的差异蛋白显著富集于“线粒体生物合成”、“氧化磷酸化”和“活性氧物种通路”。这提示ISL的神经保护作用可能与改善线粒体功能和氧化还原稳态密切相关。随后的深入机制验证结果支持了这一假设。在PC12细胞中，ISL治疗显著降低了氧糖剥夺引起的细胞内Ca2+超载和线粒体活性氧爆发，恢复了受损的线粒体膜电位，抑制了线粒体通透性转换孔的过度开放，并减少了凋亡诱导因子向细胞核的转位。这些数据表明ISL有效缓解了氧化应激损伤并改善了线粒体功能。关键的分子机制证据显示，ISL通过作用于Keap1/Nrf2轴发挥效应。体内外实验均证实，ISL促进了Nrf2从细胞质向细胞核的转位，并上调了其下游抗氧化蛋白HO-1和NQO1的表达。免疫共沉淀实验证明ISL促进了Keap1/Nrf2复合物的解离。凝胶迁移或电泳迁移率实验显示ISL增强了Nrf2与抗氧化反应元件的结合活性。分子对接模拟发现，ISL的羟基能与Keap1 Kelch结构域中的多个氨基酸残基形成氢键，这从结构上解释了ISL如何干扰Keap1与Nrf2的结合，促使其解离。此外，ISL还显著上调了线粒体生物合成关键蛋白PGC-1α、NRF1和TFAM的表达，抑制了线粒体分裂蛋白DRP1和FIS1的表达，同时促进了融合蛋白OPA1和MFN2的表达，并激活了PINK1/Parkin介导的线粒体自噬通路。这些结果表明ISL能全面改善线粒体稳态。最终，抗凋亡效应的结果与上述机制完美衔接。ISL治疗显著减少了小鼠缺血脑组织中TUNEL阳性的凋亡神经元数量，降低了促凋亡蛋白细胞色素C、凋亡诱导因子、Bax和Cleaved Caspase-3的表达，提高了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而降低了Bax/Bcl-2比值。而研究中最具说服力的证据是，当使用Nrf2特异性抑制剂Brusatol时，ISL在改善线粒体功能、上调抗氧化蛋白表达以及抑制神经元凋亡等方面的所有有益效应均被显著逆转或削弱。这一“拯救实验”结果确凿地证明了Nrf2通路的激活是ISL发挥神经保护作用的核心和必要环节。

本研究得出的核心结论是：异甘草素通过激活Keap1/Nrf2信号通路，有效减轻了脑缺血再灌注损伤后的氧化应激，并通过促进线粒体生物合成、恢复线粒体融合-分裂平衡、增强线粒体自噬等多种方式，全面改善了线粒体功能障碍，最终抑制了神经元凋亡，从而发挥显著的神经保护作用。这项研究的科学价值在于，它系统、深入地阐明了ISL对抗脑缺血再灌注损伤的一个全新的、基于Nrf2和线粒体稳态的分子机制，将ISL的抗氧化、线粒体保护和抗凋亡效应有机地串联在一个清晰的信号通路中，丰富了对于天然黄酮化合物神经保护机制的认识。其应用价值在于，ISL作为一种来源于传统药用植物的天然产物，具有开发成为新型脑卒中神经保护剂的巨大潜力，为临床缺血性卒中的治疗提供了新的候选药物和分子靶点。

本研究的亮点突出体现在以下几个方面：首先，研究设计系统全面，采用了经典的体内MCAO模型和体外氧糖剥夺模型相互印证，从整体动物行为、组织病理到细胞、分子多层次进行评估，证据链完整。其次，机制探索深入且具有说服力，不仅使用了常规的生化、分子生物学方法，还创新性地采用了数据非依赖性采集定量蛋白质组学进行无偏倚的机制初筛，并运用分子对接技术从结构层面解释化合物与靶点的相互作用。最关键的是，通过使用Nrf2抑制剂进行“功能丧失”实验，直接验证了Nrf2通路在ISL作用中的必要性，极大地提升了结论的可靠性。最后，研究聚焦于线粒体稳态这一热点领域，不仅关注了线粒体功能的基本指标，还深入探讨了线粒体生物合成、动力学和自噬等多个维度的调控，体现了对线粒体在脑缺血损伤中复杂角色的深刻理解。

其他有价值的内容包括：研究遵循了动物实验报告指南，并获得了伦理委员会批准；作者详细列出了所使用的所有抗体及稀释比例，保证了实验的可重复性；研究得到了中国国家重点研发计划、国家自然科学基金等多个重要项目的资助，显示了其受关注的程度。这项由宁夏医科大学、西安医学院和上海交通大学医学院团队合作完成的研究，为异甘草素作为脑缺血再灌注损伤治疗药物的开发奠定了坚实的临床前实验基础。