一项开创性研究：利用患者来源细胞构建微流控三维子宫壁三培养模型

作者、机构与发表信息 本研究由Caroline Busch (1,2,†), Christopher J. Hill (3,4,†), Karla Paterson (5), Ronan Mellin (5), Michele Zagnoni (2,5), Dharani K. Hapangama (3,4), 和 Mairi E. Sandison (1,) 共同完成。其中带有†标志的两位作者为并列第一作者， 为通讯作者。参与机构包括：英国思克莱德大学生物医学工程系与电子电气工程系（1, 2）、利物浦大学妇女与儿童健康系及利物浦妇女医院NHS信托基金会（3, 4），以及ScreenIn3D有限公司（5）。该研究以原创文章（Original Article）的形式发表于《Human Reproduction》 期刊，发表于2024年，文章最终接收于2024年8月30日，并于同年9月15日在线发表。

学术背景与研究目的 本研究属于生殖生物学与组织工程/器官芯片的交叉领域。人类子宫作为核心生殖器官，其复杂的结构与功能对于理解月经、妊娠及多种子宫疾病至关重要。子宫壁主要由内层的黏膜层（子宫内膜，endometrium）和外层的平滑肌层（子宫肌层，myometrium）构成，两者之间的界面称为子宫内膜-子宫肌层交界区（Endometrial–Myometrial Junction, EMJ）。EMJ在子宫腺肌病（adenomyosis）和异常侵入性胎盘等病理过程中扮演着关键角色，但其具体病因尚不清楚。目前，尽管已有多种三维（3D）子宫模型，但绝大多数仅包含子宫内膜细胞，且常使用细胞系而非患者原代细胞。更重要的是，缺乏一个同时包含子宫内膜上皮细胞、基质细胞和子宫肌层平滑肌细胞这三大EMJ关键细胞成分的患者来源体外模型。这种模型的缺失严重限制了对子宫壁生理及EMJ相关疾病机制的研究。

因此，本研究旨在利用微流控器官芯片技术，首次开发并验证一种由患者活检组织来源的原代细胞构建的三维、生理相关性的子宫壁“三培养”模型。该模型旨在模拟EMJ的细胞组成与相互作用，为研究子宫生理、病理机制以及个性化药物筛选提供一个强大的新型工具。

详细研究流程 研究流程主要分为以下几个核心步骤：

1. 患者样本获取与原代细胞分离：

   • 研究对象与样本量：研究获取了来自未服用激素药物的绝经前女性（用于良性妇科手术）的子宫内膜活检样本（n=9），以及来自足月妊娠（>37周）择期剖宫产女性的子宫肌层活检样本（n=4）。样本详细信息见补充材料。
   • 处理流程：组织经机械剪碎后，使用 Dispase II、胶原酶I和DNA酶I进行酶消化约1小时。子宫内膜消化物通过40μm细胞筛分离得到腺体部分（上皮细胞来源）和流穿部分（基质细胞）。子宫肌层消化物及子宫内膜基质部分通过Ficoll密度梯度离心去除红细胞。分离得到的细胞可冷冻保存备用。

2. 微流控芯片设计与制造：

   • 新型设备：研究使用了一种自研的多层聚二甲基硅氧烷微流控芯片。该芯片包含多个微流通道，每个通道底部集成了5×5的微孔阵列（每个微孔250×250×200 μm）。芯片表面经过特殊处理（涂覆Synperonic® F108），形成超低粘附表面，以促进细胞在微孔内形成三维聚集体，而非贴附在芯片表面生长。

3. 三维细胞培养模型的构建与优化：

   • 单细胞类型培养：首先，将单个细胞类型（平滑肌细胞、基质细胞）或小上皮细胞簇悬液注入芯片，细胞沉降到微孔中。在超低粘附条件下，平滑肌细胞和基质细胞在24-48小时内形成致密的球体，而上皮细胞单独培养则形成松散的聚集体。
   • 三培养策略探索：为构建包含上皮、基质和平滑肌细胞的三维模型，研究系统测试了多种细胞接种顺序和组合方式（如图2d所示）。关键策略包括依次接种不同细胞类型或同时接种所有细胞，并观察其自组装行为。通过活细胞荧光示踪和免疫细胞化学染色实时监测细胞命运和表型。
   • 细胞外基质（ECM）优化：研究发现，在培养体系中加入低粘度（5% [v/v]）的Matrigel®基底膜基质，能显著提高三维聚集体形成的可重复性，并促进形成更符合生理的结构：即一个由基质/平滑肌核心被上皮层包裹的球体。相比之下，100% Matrigel®固态凝胶则导致细胞类型分离和基质细胞迁移，不利于形成整合的模型。

4. 模型表征与定量分析：

   • 形态学分析：使用宽场和结构光照明（Apotome）显微镜对三维聚集体进行成像。通过图像分析软件（Zen, ImageJ）和自行编写的MATLAB程序，定量分析聚集体的尺寸、不同细胞类型的空间分布（特别是上皮细胞封装程度）等参数。评估了不同患者样本、不同接种方案（重点比较了平滑肌细胞最后接种的方案B和D）以及有无激素刺激下的模型差异。

5. 功能验证实验：

   • 激素响应与蜕膜化（Decidualization）：将模型（使用5% Matrigel®，接种方案D）暴露于模拟月经周期分泌期的激素环境中：先使用雌二醇（E2），随后联合使用E2、甲羟孕酮（MPA）和环磷酸腺苷（cAMP）。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测培养上清中胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1，基质细胞蜕膜化标志物）和骨桥蛋白（Osteopontin，上皮细胞分泌的标志物） 的分泌水平，以评估模型的激素响应功能。
   • 钙离子信号传导：使用钙离子荧光指示剂（Cal-520 AM）负载细胞，通过荧光显微镜记录三维聚集体在内皮素-1（ET-1）和催产素（OT） 刺激下的胞内钙离子浓度（[Ca2+]c）变化，以评估平滑肌细胞的功能活性。分析了仅含平滑肌细胞的球体与完整三培养模型对不同激动剂的反应差异。

6. 数据分析流程：

   • 图像数据使用Zeiss Zen、ImageJ和MATLAB进行分析，包括荧光强度量化、区域分割和尺寸测量。
   • ELISA数据使用GraphPad Prism软件通过四参数逻辑回归模型拟合标准曲线进行计算。
   • 钙成像数据经过序列帧减法和中值滤波处理，手动划定感兴趣区域（ROI）以分析单个细胞的反应动力学。
   • 统计比较使用双样本t检验等方法进行。

主要研究结果 1. 微流控平台成功支持多细胞类型三维培养的形成：开发的微流控芯片平台能够高效、并行地形成数百个独立的三维细胞聚集体，极大提高了对有限患者样本的利用率和实验通量。 2. 确定了最优三培养构建方案： * 细胞接种顺序影响最终结构。当子宫平滑肌细胞最后接种时（特别是方案D：先同时接种上皮和基质细胞，后加入平滑肌细胞），最易形成具有上皮层包裹平滑肌/基质核心的、类似子宫壁结构的单一体积聚集体。 * 加入5%低粘度Matrigel® 是获得高重复性、结构明确模型的关键。它促进了细胞的自组装，形成了稳定的“上皮包裹核心”结构，而无需使用固态凝胶。 3. 模型展现了患者特异性与结构多样性： * 模型尺寸和上皮封装程度在不同患者样本间存在差异，反映了供体异质性。经过模拟分泌期的激素刺激后（培养第15天），模型的上皮封装率普遍提高（>80%）。 * 在大量培养中，偶尔观察到罕见的上皮核心被平滑肌细胞包裹的结构，这可能为模拟腺肌病的发病机制提供了线索。 * 免疫染色证实，在形成的三维结构中，上皮细胞表达连接蛋白E-钙黏蛋白（E-cadherin）和雌激素受体β（ER-beta），显示了其功能极性。 4. 模型具有关键生理功能： * 蜕膜化响应：来自分泌期子宫内膜的三培养模型，在激素（E2+MPA+cAMP）刺激下，IGFBP-1和骨桥蛋白的分泌均显著增加。尽管不同供体的反应强度有差异，但所有模型均表现出一定程度的蜕膜化响应，证明了模型的功能相关性。 * 平滑肌细胞收缩响应： * 仅含平滑肌细胞的球体对ET-1刺激表现出强烈且广泛的钙离子响应。 * 在完整的三培养模型中，钙离子响应呈现结构依赖性：缺乏完整上皮层包裹的聚集体对ET-1有反应；而具有完整上皮层包裹的、更大的“子宫样”聚集体则对ET-1无反应。这可能提示完整的上皮层形成了屏障功能。相比之下，所有模型对催产素的反应均较弱，这与使用的平滑肌细胞来源于妊娠子宫，但在三维共培养中可能向非妊娠表型转变的观察相符。

结论与意义 本研究首次成功建立并验证了一种基于患者原代细胞的、功能化的三维微流控子宫壁三培养模型。该模型整合了子宫内膜上皮细胞、基质细胞和子宫肌层平滑肌细胞，模拟了子宫内膜-子宫肌层交界区（EMJ）的关键细胞组成。

其科学价值与应用前景在于： 1. 填补研究空白：提供了首个包含患者来源子宫肌层细胞的EMJ体外模型，为研究EMJ在生理和病理（如腺肌病、胎盘植入）中的作用机制提供了前所未有的工具。 2. 高生理相关性：使用患者原代细胞，更好地保留了体内细胞的异质性和功能特性，比细胞系模型更具生理和病理相关性。 3. 高通量潜力：微流控芯片的微型化与阵列化设计，使得能够从单次活检中平行筛选数百个培养条件，适用于中等通量的药物筛选和个性化医疗研究。 4. 揭示新现象：模型发现的结构依赖性钙信号响应（上皮屏障可能影响平滑肌兴奋性）为理解子宫壁不同区域的细胞通信提供了新视角。 5. 疾病建模与个性化医疗：该模型有望用于模拟慢性妇科疾病（如腺肌病、子宫内膜异位症、子宫肌瘤），并评估患者个体对治疗的反应差异，推动个性化治疗策略的发展。

研究亮点 1. 创新性模型：这是首个报道的、由患者原代细胞构建的、包含全部EMJ主要细胞类型的三维子宫壁器官芯片模型。 2. 技术方法优化：明确了使用低粘度ECM（5% Matrigel®） 和特定细胞接种顺序（平滑肌细胞最后加入）是构建稳定、结构规整模型的关键优化条件。 3. 功能验证全面：不仅进行了形态学表征，还通过激素诱导的蜕膜化反应和激动剂诱导的钙信号两个关键生理功能实验，充分证明了模型的生物学功能。 4. 平台优势突出：充分利用了微流控技术的微型化、并行化优势，解决了患者原代细胞数量有限的问题，为转化医学和个性化研究提供了可扩展的平台。

其他有价值内容 研究也坦承了其局限性：样本量相对较少；子宫肌层组织来源于妊娠女性，可能影响平滑肌细胞表型；子宫内膜取样可能未包含较深的基底层，这可能限制模型对深层子宫内膜的模拟。这些均为未来研究的改进方向指明了道路。此外，作者指出未来可结合高分辨率成像（如电镜）、空间转录组学或单细胞测序等技术，进一步深入解析三维共培养体的细胞表型和功能组织。研究得到了多个基金项目的支持，并声明了相关的利益冲突（部分作者与ScreenIn3D公司有关联）。