作者与发表信息
本文是一篇发表于 Frontiers in Immunology 的科学综述，题为“vNAR: Shark Single-Domain Antibodies for the New Era of Medical Biotechnology”，于2026年2月2日发表。主要作者为 Richard A. Olivares-Olivares 和 Margarita K. Lay 等，研究机构包括智利安托法加斯塔大学（Universidad de Antofagasta）生物技术系、安托法加斯塔生物医学免疫学与生物技术研究中心（CIIBBA）、智利中央大学（Universidad Central de Chile）以及智利天主教大学（Pontificia Universidad Católica de Chile）等。
论文主题与核心内容
本文系统综述了鲨鱼来源的单域抗体（single-domain antibodies，sdAbs）——即 vNAR（variable new antigen receptor domain，可变新抗原受体结构域）——在结构生物学、展示技术、文库构建以及生物医学应用方面的最新进展。全文围绕 vNAR 相较于传统抗体和骆驼科 VHH 的独特优势展开，并重点讨论了其在免疫诊断、肿瘤免疫治疗、感染性疾病以及跨屏障递送等领域的转化潜力。
第一个核心观点：vNAR 的结构特征赋予其独特的生物医学功能优势
论文首先详细阐述了 vNAR 的结构基础。vNAR 来源于软骨鱼类（如护士鲨、竹鲨等）的免疫球蛋白新抗原受体（IgNAR），分子量仅约12–15 kDa，是已知脊椎动物中最小、最原始的功能性免疫球蛋白结构域。与传统抗体不同，vNAR 完全缺乏轻链和 CH1 结构域，其可变区仅包含两个经典互补决定区（CDR1 和 CDR3）以及两个额外的高变区（HV2 和 HV4）。其中 CDR3 的长度可超过40个氨基酸，远长于人类抗体，并能形成“指状”凸起结构，使得 vNAR 能够深入酶活性裂隙、隐藏表位和致密组织微环境。根据非经典半胱氨酸的位置和二硫键的连接模式，vNAR 被分为四种类型（Type I–IV），其中 Type II 通过 CDR1–CDR3 间的额外二硫键稳定延长的 CDR3 构象，是最常用于文库设计的骨架类型。这些结构特征被多个晶体学研究（如 PDB ID: 2YWZ）和序列保守性分析所支持，也解释了 vNAR 在极端 pH、高温（可达80–95°C）、去垢剂及蛋白酶环境中的高稳定性与高溶解度。
第二个核心观点：多样化的展示技术平台支撑 vNAR 的高效筛选
论文系统比较了用于 vNAR 筛选的四种主要展示技术。噬菌体展示（phage display）是最成熟且使用最广泛的技术，文库容量通常为10⁹–10¹⁰，并可通过多轮生物淘选获得低纳摩尔甚至亚纳摩尔亲和力的结合物；其优势在于大肠杆菌氧化性周质环境有利于二硫键正确形成。核糖体展示（ribosome display）是完全体外进行的技术，文库容量可达10¹²–10¹⁴，且可在3–5天内完成多轮筛选，极大提高了获得稀有高亲和力克隆的概率；但由于缺乏细胞伴侣系统，含多个二硫键的 vNAR 需要优化氧化折叠条件。酵母表面展示（yeast display）利用酿酒酵母 Aga2p 蛋白实现 vNAR 的细胞表面展示，结合流式细胞术（FACS）可实现亲和力的定量测量和多参数分选；虽然文库容量较低（10⁶–10⁸），但真核折叠机制更适合含额外二硫键的 vNAR 正确折叠。细菌表面展示（bacterial display）虽然尚未在已发表的 vNAR 筛选实例中广泛应用，但在 VHH 筛选中已展示了亚纳摩尔亲和力和高通量诱变的潜力，被认为是 vNAR 工程中具有良好前景的补充平台。论文还以表格形式对四种展示技术的文库大小、处理速度、成本和可扩展性进行了直观对比。
第三个核心观点：多种文库构建策略各有优势与局限
论文将 vNAR 文库分为四类并逐一分析。免疫文库（immune libraries）通过鲨鱼免疫特定抗原来富集体内亲和力成熟的 IgNAR 库，通常可获得纳摩尔至亚纳摩尔亲和力的结合物，且无需进一步的体外亲和力成熟；然而其制备周期长达数月，受限于动物伦理和物种个体差异，且文库高度偏向免疫原。天然文库（naïve libraries）来自未经免疫的多个鲨鱼供体，文库多样性可达10⁹–10¹⁰，可反复用于不同靶标的筛选。实例包括从天然护士鲨文库中分离出针对 SARS-CoV-2 S2 亚基的广谱中和 vNAR，以及在95°C处理后仍保持活性的霍乱毒素结合 vNAR；但初始亲和力通常在微摩尔至低纳摩尔范围，需后续体外成熟。半合成文库（semi-synthetic libraries）将天然 vNAR 骨架与体外工程化的 CDR 多样性结合，多样性与天然文库相当，但具有更高的可表达性和正折叠率；已成功用于筛选抗独特型 vNAR 和 BAFF 特异性调节域。全合成文库（synthetic libraries）完全基于计算机设计，可探索自然界中从未出现过的序列空间，但功能克隆比例较低，需通过密码子优化和结构约束设计来提高质量。论文强调，随着下一代测序（NGS）的整合，文库筛选过程中的克隆富集追踪和候选优先排序效率得到了显著提升。
第四个核心观点：vNAR 在免疫诊断和感染性疾病检测中展现出革命性优势
论文引用了多项实验证据支持这一观点。在侧向流快速诊断试纸条中，传统单克隆抗体在45°C储存数周后即迅速失活，而 vNAR 在相同条件下几乎保持100%的结合功能，这对于缺乏冷链的热带和资源有限地区具有重大意义。在疟疾检测中，识别顶端膜抗原1（AMA1）的 vNAR 通过延长的 CDR3 深入寄生虫保守表位的疏水裂隙，为广谱诊断试剂开发提供了思路。在病毒检测方面，vNAR 已成功应用于埃博拉病毒核蛋白、乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）和霍乱毒素的检测。例如，针对 HBsAg 的 vNAR 来自竹鲨（*Chiloscyllium plagiosum*）免疫文库，三个候选克隆在夹心 ELISA 中表现出强特异性和结合力，为资源受限地区的 HBV 快速诊断奠定了平台基础。针对霍乱毒素的 vNAR 在 Luminex 微球阵列中可检测低至1 ng/mL 的毒素浓度。
第五个核心观点：vNAR 在肿瘤免疫治疗中具备独特的转化潜力
论文重点介绍了 vNAR 在嵌合抗原受体 T 细胞（CAR-T）疗法中的应用。以 PD-L1 为靶点的 vNAR B2 是从一个 CDR3 长度为18个氨基酸的半合成噬菌体文库中筛选得到的，它能功能性阻断人 PD-L1 与 PD-1 的相互作用。在 TNBC（三阴性乳腺癌）和 HCC（肝细胞癌）小鼠移植瘤模型中，基于 B2 的 CAR-T 细胞显著抑制了肿瘤生长；更重要的是，在 HCC 模型中，同时靶向 PD-L1 和 GPC3 的双抗原 CAR-T 组合疗法表现出优于单靶点 CAR-T 的疗效，为实体瘤的联合免疫治疗提供了新策略。此外，vNAR 还被设计用于干扰血管内皮生长因子（VEGF）信号通路以抑制肿瘤血管生成。
第六个核心观点：vNAR 是跨屏障递送的理想载体
血脑屏障（BBB）和眼角膜屏障是传统抗体难以穿透的生理屏障，而 vNAR 的小尺寸和结构稳定性使其成为理想的递送工具。论文详细介绍了 TXB2 平台，这是一个基于合成噬菌体文库筛选得到的靶向转铁蛋白受体1（TfR1）的 vNAR，能以高亲和力、跨物种地结合 TfR1 胞外域，并通过受体介导的转胞吞作用穿过 BBB，且不干扰转铁蛋白或铁蛋白的正常结合。作为 Fc 融合双价蛋白，TXB2 展现出良好的药代动力学和安全特性，为神经退行性疾病和脑肿瘤的非侵入性治疗开辟了新路径。在眼部递送方面，来自角鲨（*Heterodontus francisci*）免疫文库的 vNAR V13 靶向 VEGF165，在小鼠角膜擦伤模型中无需注射即可穿透角膜，为眼血管疾病的局部滴眼治疗提供了可能性。
第七个核心观点：vNAR 的人源化面临独特挑战
论文指出，鲨鱼 vNAR 与人类 VH/VL 结构域的序列同源性仅约30%，远低于骆驼 VHH 与人类的约80%同源性。因此，简单的框架表面残基替换策略并不适用于 vNAR。vNAR 的框架区域本身直接参与抗原结合，且其独特的 CDR3–FR2/FR4 或 CDR1–CDR3 间的额外二硫键对于维持延长的 CDR3 构象至关重要。强行套用人类 VH/VL 框架可能导致折叠破坏和结合力丧失。首个成功的人源化案例是 Kovalenko 等人对 E06 克隆的改造，通过将超过60%的非 CDR 残基替换为人类同源序列，获得了保留原始构象和功能的人源化 vNAR。此外，由于 vNAR 分子量小、肾清除快，半衰期延长策略（如与白蛋白融合、构建 vNAR-Fc 融合蛋白或 PEG 化）对于临床转化至关重要。
论文的意义与价值
本文是第一篇全面综述 vNAR 从基础结构生物学到临床应用转化的综合性论文。其学术价值在于系统整合了 vNAR 结构分类、展示技术、文库工程和跨疾病应用的最新进展，并明确指出了 vNAR 相较于骆驼 VHH 的结构差异及其在靶向隐匿表位方面的不可替代性。其应用价值在于为肿瘤免疫治疗、感染性疾病诊断、跨 BBB 和角膜药物递送以及极端环境下诊断试剂开发提供了可操作的技术路线图，同时指出了人源化和半衰期延长这两大临床转化瓶颈的解决方向。