本文发表于 Cell Stem Cell（2015年1月8日，第16卷，第51–66页），通讯作者为 Rafael Kramann（任职于哈佛医学院布莱根妇女医院肾内科，同时隶属德国亚琛工业大学）和 Benjamin D. Humphreys（任职于哈佛医学院布莱根妇女医院肾内科及哈佛干细胞研究所）。研究团队主要来自哈佛医学院、布莱根妇女医院、哈佛干细胞研究所以及波士顿大学医学院病理与检验医学系。该研究属于器官纤维化与间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）生物学领域，核心问题是明确损伤后器官纤维化中肌成纤维细胞（myofibroblasts）的细胞来源，特别是血管周围间充质干细胞样细胞在其中的功能。

器官纤维化是慢性肾脏病、心力衰竭、肝硬化和肺纤维化等重大疾病的共同终末通路，其本质是过度细胞外基质沉积和肌成纤维细胞扩增。既往研究已经发现血管周围细胞可能是肌成纤维细胞的来源之一，但由于缺乏特异性的体内标记工具，尚无法在遗传命运示踪水平上直接证明某一特定血管周围细胞亚群在纤维化中的贡献。同时，间充质干细胞的体内功能长期不明确，传统上认为外源性间充质干细胞具有修复作用，但内源性间充质干细胞样细胞在慢性损伤中的真实角色并未得到充分验证。该研究的目标是检验Gli1是否可以作为成体多器官血管周围间充质干细胞样细胞的标志物，并通过遗传命运示踪和细胞消融策略明确这些细胞在肾、心、肺、肝纤维化中的作用。

在实验流程方面，研究者首先构建了Gli1-CreERT2；tdTomato报告基因小鼠，通过他莫昔芬诱导标记表达Gli1的细胞，利用免疫荧光、免疫金标电子显微镜和荧光微血管造影确认Gli1+细胞在主动脉外膜、小动脉周围以及毛细血管周细胞龛中的分布，并检测其与CD31+内皮细胞和PDGFRβ表达的关系。接着通过流式细胞分选从骨髓、肌肉、心脏、肺、肝和肾中分离Gli1+细胞，体外培养后诱导成骨、成软骨和成脂三系分化，并通过全器官流式分析其表面标志物谱。为比较不同PDGFRβ+亚群的克隆形成能力，研究者分选了Gli1+PDGFRβ+、Gli1−PDGFRβ+和PDGFRβ−Gli1−细胞，进行集落形成单位成纤维细胞（CFU-F）实验。同时采用骨髓骨片培养法获得骨髓间充质干细胞，并在体外检测Hedgehog信号通路调控Gli1+细胞自我更新的能力，使用SHH、环巴胺和GANT61等激动剂或抑制剂干预。

在损伤模型方面，研究者对肾脏采用单侧输尿管梗阻（UUO）和双侧缺血再灌注损伤（IRI），对心脏采用血管紧张素II（AT2）诱导的高血压心肌纤维化和升主动脉缩窄（AAC）诱导的压力超负荷心力衰竭，对肝脏采用四氯化碳（CCl4）诱导肝纤维化，对肺采用博来霉素诱导肺纤维化。通过遗传命运示踪分析Gli1+细胞在损伤后的增殖、扩增和向α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）+肌成纤维细胞分化的情况。为区分组织驻留细胞与循环来源细胞，研究者还进行了骨髓移植和并体实验（parabiosis），将Gli1-CreERT2；tdTomato小鼠的骨髓或循环与CD45.1受体小鼠共享，观察循环Gli1+细胞是否归巢至受损器官并参与肌成纤维细胞形成。在功能验证方面，研究者构建了Gli1-CreERT2；iDTR小鼠，通过白喉毒素（DTX）条件性消融Gli1+细胞，在UUO和AAC模型中比较纤维化程度和心脏射血分数变化。此外，研究还通过3D胶原凝胶内皮管形成实验、Matrigel栓血管生成实验以及NG2和CD146表达分析，探讨Gli1+细胞在内皮管相关和血管新生中的行为。数据分析主要采用共聚焦显微镜高倍视野定量、流式细胞术、qPCR、Western blot和组织化学染色，统计学方法包括t检验和单因素方差分析。

结果显示，Gli1+细胞广泛分布于成年小鼠各主要器官的血管周围，形成从大动脉外膜到毛细血管周细胞龛的连续网络，并表达典型间充质干细胞表面标志物，如PDGFRβ、CD44、CD29、CD105、Sca1，同时不表达CD31和CD45。体外实验中，Gli1+细胞具有三系分化能力和较高的CFU-F形成频率，虽然其仅占PDGFRβ+细胞群的一小部分，但其克隆形成能力显著高于Gli1−PDGFRβ+和PDGFRβ−Gli1−细胞。Hedgehog通路抑制实验表明，直接抑制Gli1可降低Gli1蛋白水平并减少集落形成，提示Gli1可能参与间充质干细胞样细胞的自我更新。

在肾和心脏损伤模型中，Gli1+细胞在损伤后显著增殖并扩增，绝大多数获得α-SMA表达，转化为肌成纤维细胞。肾脏中约45%的肌成纤维细胞和心脏中约60%的肌成纤维细胞来源于Gli1+前体细胞。在肝和肺纤维化模型中，Gli1+细胞也分别贡献约39%和37%的间质α-SMA+细胞。骨髓移植和并体实验表明，循环中的Gli1+细胞在肾纤维化中几乎不参与肌成纤维细胞池的形成，提示纤维化中的肌成纤维细胞主要来自组织驻留的Gli1+细胞。白喉毒素消融实验显示，在UUO模型中，去除Gli1+细胞可使肾纤维化程度降低约50%；在AAC模型中，消融Gli1+细胞不仅减轻心肌间质纤维化和心肌肥厚，还显著保留左心室射血分数，改善心脏功能。此外，在体内外血管生成实验中，Gli1+细胞在新生血管形成中可上调NG2和CD146表达，与CD31+内皮细胞密切接触；TGF-β诱导其向肌成纤维细胞分化后，其与内皮管关联能力下降，而SHH和VEGF处理则增强其与内皮管的关联。

该研究的核心结论是：Gli1标记了成体多器官中一类血管周围间充质干细胞样前体细胞，这些细胞在慢性器官损伤后是肌成纤维细胞的主要来源，并且其消融可以减轻纤维化、保护器官功能。这一发现一方面确立了Gli1+血管周围细胞作为器官纤维化关键细胞起源的地位，另一方面挑战了间充质干细胞在损伤中仅发挥保护性作用的传统观点，提示内源性间充质干细胞样细胞在慢性损伤中也可能加剧病理重塑。其科学价值在于提供了直接遗传命运示踪证据，明确了组织驻留血管周围前体细胞在纤维化中的功能，并揭示了针对该细胞亚群进行抗纤维化治疗的可能性。临床转化价值在于，Gli1+细胞有望成为防治心肾等实质器官纤维化的新靶点。

该研究的几个重要亮点包括：第一，首次在多器官水平证明Gli1是血管周围间充质干细胞样细胞的广谱标记，并成功利用该标记进行遗传命运示踪；第二，通过骨髓移植和并体实验排除了循环来源细胞对纤维化中肌成纤维细胞池的主要贡献，强化了组织驻留前体细胞的核心地位；第三，利用条件性消融模型直接证明去除Gli1+细胞可以减轻肾和心脏纤维化并改善心脏功能；第四，发现了Gli1+细胞在纤维化和血管新生中的双重潜能，提示其在不同损伤阶段可能发挥不同作用。此外，实验方法上，研究将荧光微血管造影、免疫金标电镜、骨片培养、3D内皮管形成和并体模型结合，形成了从定位、功能到干预的多层次证据链，为后续器官纤维化细胞起源研究提供了可借鉴的技术路径。