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非经典组织单核细胞与两个功能不同的间质巨噬细胞亚群在小鼠肺内的分布

主要作者与研究机构

本研究由来自比利时列日大学GIGA研究所免疫生理学实验室的Joey Schyns、Qiang Bai、Cecilia Ruscitti、Coraline Radermecker、Thomas Marichal等人，以及新加坡免疫学网络（SIgN）的Florent Ginhoux、比利时鲁汶大学的Guy Boeckxstaens等学者合作完成。通讯作者为列日大学的Thomas Marichal。该研究于2019年发表在《自然·通讯》（Nature Communications）上，文章编号为10:3964。

研究背景

组织驻留巨噬细胞（resident tissue macrophages, RTM）广泛存在于哺乳动物的大多数组织中，在发育、稳态维持、炎症反应以及组织修复等过程中发挥着多种功能。在肺脏中，除了广为人知的肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages, AM）以外，还存在非肺泡的肺巨噬细胞，即间质巨噬细胞（interstitial macrophages, IM）。已有的研究表明，IM对肺脏免疫稳态具有重要贡献，能够自发产生免疫抑制性细胞因子白介素-10（IL-10），从而阻止针对吸入性过敏原的异常2型过敏反应的发生。然而，IM长期以来仅被作为一个整体进行研究，对其内部异质性的认识十分有限。近年来，虽然有研究提出了IM存在不同亚群的观点，但这些亚群的起源、寿命、定位和功能特性仍未被充分阐明。因此，本研究旨在利用单细胞RNA测序（single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq）等技术，深入解析小鼠肺脏IM的异质性，并探讨不同IM亚群的个体发育路径及其功能特征，为未来巨噬细胞靶向治疗策略的制定提供基础。

研究流程与实验方法

本研究首先对来自未经处理的C57BL/6野生型小鼠的肺脏组织单个核细胞进行了流式细胞术分选，以获取CD64阳性的IM群体。分选策略为：单细胞、CD45阳性、非自发荧光、低侧向散射（SSC low）、F4/80阳性、CD11c阴性、Ly-6C低表达以及CD64阳性。同时，为了作为对照，研究者还分选了肺泡巨噬细胞（AM），并以1:10的比例掺入IM样本中。

随后，研究者使用10x Genomics平台对分选到的细胞进行了基于液滴的单细胞RNA测序。实验分为两个独立批次：第一批使用10周龄小鼠，共分析了1715个IM和199个AM；第二批使用6个月龄且来自不同动物设施的小鼠，共分析了1682个IM。两批数据在质控和过滤后合并分析，共得到3596个CD64表达细胞。

在数据分析方面，研究者使用了R语言中的Seurat包进行下游处理。质控标准为：每个细胞检测到的基因数在200到2500之间，线粒体基因比例低于5%。基因表达数据经过全局归一化处理，并利用高变基因进行主成分分析（PCA）。随后，研究者采用了图聚类（graph-based clustering）方法对细胞进行分群，并通过t分布随机邻域嵌入（t-SNE）进行非线性降维可视化。差异表达分析使用Seurat中的FindMarkers函数，筛选标准为校正后p值小于0.01。此外，研究者还利用基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析来探究各亚群的功能特征。

为了在蛋白水平验证测序结果，研究者利用流式细胞术检测了CD206和CD16.2等表面标志物的表达，并通过免疫荧光染色进行了形态学观察。细胞吞噬功能通过荧光标记的大肠杆菌生物颗粒进行检测。此外，研究者还使用了多种小鼠模型：利用他莫昔芬诱导的Cx3cr1CreERT2.ROSA26-lsl-YFP命运追踪小鼠来评估IM亚群的寿命；利用Ccr2−/−和Nr4a1−/−基因敲除小鼠来探究单核细胞来源的依赖性；利用IL-10-β-内酰胺酶报告基因小鼠（ITIB）来检测IL-10的表达；并通过骨髓竞争性嵌合体模型和过继转移实验来验证单核细胞向IM的分化路径。在生物信息学层面，研究者还应用了RNA速率（RNA velocity）分析和Slingshot拟时序分析来推断细胞分化轨迹。

主要研究结果

单细胞RNA测序分析揭示了肺脏CD64阳性的单个核吞噬细胞可分为四个转录上不同的细胞簇。其中，第3簇为肺泡巨噬细胞，而第1、2和4簇则对应于IM群体。进一步的分析发现，第1簇高表达MHC-II相关转录本（如H2-Eb1、H2-Ab1、Cd74），第2簇高表达编码CD206的Mrc1、Cd163、Folr2和Lyve1，第4簇则高表达Ace和编码CD16.2的Fcgr4。流式细胞术验证了这些发现，确认CD206和CD16.2的表达在CD64阳性IM中是相互排斥的，从而鉴定出三个亚群：CD16.2阳性CD206阴性细胞（称为CD64+CD16.2+单核细胞）、CD16.2阴性CD206阳性细胞（称为CD206+ IM）以及CD16.2阴性CD206阴性细胞（称为CD206− IM）。

形态学上，CD206+ IM的胞质中独特地含有大量溶酶体空泡，且细胞体积较大。表型上，CD206− IM表达更高水平的CX3CR1，而CD206+ IM则表达更高水平的MerTK和CD68。CD64+CD16.2+细胞则表现出更高的CD11b和CD115表达，以及较低的MerTK表达，提示其单核细胞属性。通过静脉注射荧光标记的抗CD45抗体进行血管内标记实验，研究者证实AM、CD206+ IM和CD206− IM主要位于血管外，而CD64+CD16.2+单核细胞中有相当一部分真正位于肺组织内。

命运追踪实验显示，CD206+ IM和CD206− IM在成体小鼠中均具有较长寿命，且能够自我维持，但CD206+ IM的半衰期显著长于CD206− IM。Ki-67增殖标记检测也表明CD206+ IM的增殖能力更强。相反，CD64+CD16.2+单核细胞在Nr4a1−/−小鼠中显著减少，表明其依赖于Nr4a1，而两个IM亚群的数量则不受Nr4a1缺失的影响。此外，CD64+CD16.2+单核细胞在转录组水平上与血管内巡逻单核细胞（Ly-6Clo monocytes）存在明显差异，且上调了许多IM相关基因，提示其已受到肺组织微环境的印迹。

在组织定位方面，共聚焦显微镜分析显示，CD206+ IM优先分布于支气管间质，而CD206− IM和CD64+CD16.2+单核细胞则主要位于肺泡间质。此外，CD206+ IM与血管的关联更为密切。

功能分析表明，CD206+ IM具有突出的趋化因子和免疫调节性细胞因子分泌特征，能够产生高水平的IL-10、IL-1ra、LIF、Areg等分子。相反，CD206− IM则展现出典型的抗原呈递细胞特征，高表达与抗原加工和呈递相关的转录本，并分泌更多的PTX3、IL-12p40、CXCL13和CCL5。在TLR配体刺激下，CD206+ IM主要增强趋化因子和免疫调节因子的分泌，而CD206− IM则主要增加PTX3、IL-12p40和CCL5的分泌。ITIB报告基因小鼠实验进一步证实，CD206+ IM中IL-10阳性细胞的比例显著高于其他亚群。

在体内给予TLR配体后，研究者观察到IM亚群的动态变化。LPS和Pam3CSK4处理可诱导CD64+CD16.2+细胞的短暂增加，随后出现CD206− IM的扩增。而CpG处理则引起更强烈且持久的CD64+CD16.2+细胞扩增，且其中大部分细胞表达IL-10，随后CD206− IM数量逐渐增加，在第14天达峰。

RNA速率分析和Slingshot拟时序分析表明，CD64+CD16.2+单核细胞处于高度动态的过渡状态，其分化方向指向CD206− IM。骨髓竞争性嵌合体实验显示，CD64+CD16.2+单核细胞的重建具有Nr4a1依赖性，支持其来源于Ly-6Clo巡逻单核细胞。过继转移实验也发现，Ly-6Clo单核细胞可以在转移后7天内在受体肺脏中形成CD206− IM。此外，Nr4a1−/−和Il10−/−小鼠在CpG刺激后均出现高死亡率，且伴有异常炎性单核细胞的积聚，表明Nr4a1依赖的细胞和IL-10在对抗CpG毒性中发挥了保护作用。

结论与意义

本研究通过单细胞转录组学、谱系追踪、基因敲除模型以及多种功能实验，系统阐明了小鼠肺脏CD64阳性单个核吞噬细胞的异质性。研究确认了肺脏IM存在两个功能迥异的长寿命亚群：CD206+ IM和CD206− IM。CD206+ IM位于支气管间质，具有自我更新能力、较长的半衰期以及突出的免疫调节和趋化因子分泌功能；而CD206− IM则主要位于肺泡间质，表现出抗原呈递细胞的特征。更重要的是，本研究揭示了一条个体发育路径：血管内的Ly-6Clo巡逻单核细胞在Nr4a1的调控下进入肺组织，经过CD64+CD16.2+单核细胞的过渡状态，最终分化为CD206− IM。这些发现极大地丰富了对肺脏单核吞噬细胞系统复杂性的认识，为未来开发针对特定巨噬细胞亚群的精准治疗策略提供了重要的理论基础和实验依据。

研究亮点

本研究的亮点在于：第一，通过独立的两批scRNA-seq实验，确证了肺IM可分为CD206+和CD206−两个功能不同的亚群，并明确了它们在解剖定位、寿命维持和功能特性上的差异；第二，首次鉴定并详细描述了CD64+CD16.2+单核细胞这一处于分化过渡态的细胞群体，并利用RNA速率分析、骨髓嵌合体和过继转移等多种手段，提供了其来源于Ly-6Clo巡逻单核细胞并向CD206− IM分化的有力证据；第三，揭示了Nr4a1和IL-10在CpG诱导的炎症反应中的保护作用，将单核细胞来源、IM扩增与免疫调节功能联系了起来。