本研究由Ruoyu Mao、Da Teng、Xiumin Wang、Yong Zhang、Jian Jiao、Xintao Cao和Jianhua Wang*共同完成，作者团队来自中国农业科学院饲料研究所基因工程实验室及农业农村部饲料生物技术重点实验室。研究成果发表于2015年的《BMC Microbiology》期刊（DOI: 10.1186/s12866-015-0389-5），题为《Optimization of expression conditions for a novel NZ2114-derived antimicrobial peptide-MP1102 under the control of the GAP promoter in Pichia pastoris X-33》。

学术背景

随着抗生素多重耐药菌感染的威胁加剧，抗菌肽（Antimicrobial Peptides, AMPs）因其独特的作用机制成为替代疗法的候选者。Plectasin是从真菌中发现的防御素类抗菌肽，其衍生变体NZ2114对革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌）表现出更强活性。本研究在此基础上前瞻性设计了三突变位点（N9E/L13V/R14K）的新型抗菌肽MP1102，其最小抑菌浓度（MIC）优于NZ2114。然而，抗菌肽的高生产成本限制了其应用，因此团队选择毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统，利用组成型甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAP）启动子替代传统的甲醇诱导型AOX启动子，以简化发酵流程并降低成本。

研究流程

1. 载体构建与转化

   • 将MP1102基因插入含GAP启动子的载体pgapmp1102（GenBank登录号KP636420），通过电穿孔转化至毕赤酵母X-33菌株。阳性转化子通过PCR和测序验证，并在含Zeocin的YPD培养基中筛选高表达菌株。

2. 碳源与培养基优化

   • 碳源筛选：比较葡萄糖、甘油和麦芽糖（浓度10-50 g/L）对表达的影响。结果显示40 g/L葡萄糖条件下产量最高（总蛋白67.8 mg/L，MP1102 27.8 mg/L，活性6400 AU/mL）。
     
   • 培养基优化：测试6种培养基，发现改良FM22（Med-1）效果最佳。进一步添加工业级酵母提取物和蛋白胨（HRBS品牌）使产量提升至280.41 mg/L（总蛋白）和120.57 mg/L（MP1102），成本仅为研究级试剂（Oxoid）的1/3。

3. 5-L发酵罐条件优化

   • 在pH 5.0-7.0范围内进行分批补料发酵。pH 6.5时产量达峰值：总蛋白1213.64 mg/L，MP1102 538.17 mg/L，活性153,600 AU/mL，生产效率（285,412 AU/mg）显著高于pH 5.0（104,464 AU/mg）。此外，GAP启动子避免了AOX系统因甲醇快速诱导导致的Kex2蛋白酶切割不完全问题。

4. 纯化与鉴定

   • 通过阳离子交换层析（SP FF柱）两步纯化，获得纯度96.8%的MP1102，分子量4382.9 Da（MALDI-TOF MS验证与理论值4383 Da一致），最终收率376.89 mg/L，活性回收率82.9%。

主要结果

• 表达效率：GAP启动子驱动的MP1102产量（538.17 mg/L）超过AOX系统（695 mg/L）的70%以上，且无需甲醇诱导。
  
• 经济性：工业级培养基使成本降低3-7倍，为规模化生产提供可行方案。
  
• 活性验证：纯化产物对金黄色葡萄球菌ATCC 25923的抑菌活性达153,600 AU/mL，证实其功能完整性。

结论与价值

本研究首次实现GAP启动子在毕赤酵母中高效表达抗菌肽MP1102，产量为目前同类报道最高水平。其科学价值在于：
1. 方法学创新：建立了非甲醇依赖的抗菌肽生产体系，解决了传统AOX系统的安全与操作瓶颈；
2. 产业化潜力：通过工业级原料优化，显著降低生产成本；
3. 应用前景：为多重耐药菌感染提供了新型治疗候选分子。

研究亮点

• 产量突破：GAP启动子表达量达538.17 mg/L，刷新了毕赤酵母组成型表达抗菌肽的记录。
  
• 工艺优化：pH动态控制与工业级培养基的联用策略具有普适性参考价值。
  
• 质量可控性：纯化产物高纯度（96.8%）和准确分子量验证了工艺稳定性。
  

此外，研究还发现MP1102在pH 6.5时具有最佳折叠构象，其活性单位与蛋白含量的比值显著高于其他pH条件，提示环境pH可能影响抗菌肽的翻译后修饰或分泌效率。这一发现为后续抗菌肽结构-功能关系研究提供了新方向。