类型A

研究作者与发表信息

本项开创性研究由来自中山大学附属第三医院胃肠外科的Zehong Chen、Xi Ouyang、Jiafeng Fang、Hongbo Wei以及中心实验室的Xiaoyan Han和Xuna Huang共同完成。其中，Zehong Chen和Xiaoyan Han为共同第一作者，Hongbo Wei（魏洪波）为通讯作者。该研究成果于2019年8月14日发表在国际知名学术期刊《Theranostics》上（2019; 9(22): 6354-6368）。

研究背景与目的

勃起功能障碍（erectile dysfunction，ED）被定义为无法获得或维持足以进行满意性行为的勃起能力，这是一种严重影响男性身心健康的疾病。流行病学研究显示，截至2015年，全球已有超过3亿男性受其困扰。其中，术后ED是盆腔手术的一种重要并发症，在ED病例中占很大比例。这类ED源于神经血管束的损伤，特别是在进行根治性肿瘤切除时，对如海绵体神经（cavernous nerve，CN）等关键神经的损伤有时难以避免。尽管磷酸二酯酶-5（phosphodiesterase-5，PDE5）抑制剂在临床中被尝试用于阴茎康复，但其疗效有限，且部分患者无法耐受其副作用。因此，临床上迫切需要新的治疗策略。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）因其多向分化潜能和旁分泌修复功能，在再生医学领域展现出巨大潜力。已有研究证实，MSC移植能够改善大鼠海绵体神经损伤（cavernous nerve injury，CNI）引起的ED。然而，传统MSC来源（如骨髓、脂肪）的获取过程具有侵入性，且细胞在体外扩增能力低、易衰老，这限制了其临床应用。诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）技术的发展为解决这些问题提供了可能。iPSC可通过重编程体细胞获得，继而能分化为间充质干细胞，即诱导多能干细胞来源的间充质干细胞（induced pluripotent stem cell–derived mesenchymal stem cells，iMSC）。iMSC具备无创获取、易于扩增和均一性更好等优点，但关于其是否对CNI-ED具有治疗作用，在此之前尚无研究。因此，本研究旨在建立大鼠CNI-ED模型，首次评估iMSC移植对其的治疗效果，并探索其潜在机制。

详细研究工作流程

本研究的工作流程主要包括以下几个部分：细胞制备与鉴定、动物模型建立与分组、勃起功能评估、组织学及分子生物学检测、以及治疗机制探索。

首先，在细胞制备与鉴定阶段，研究者从商业来源（ATCC）购买iPSC，并在特定的培养基和基质胶包被的培养板上进行维持培养。通过更换为添加了特定生长因子的诱导培养基，促使iPSC分化为iMSC。同时，从健康年轻男性志愿者捐赠的脂肪组织中，按照已报道的标准方案分离并培养了脂肪来源的间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSC）。随后，研究者采用流式细胞术对这两种细胞进行了鉴定。结果显示，iMSC阳性表达经典的MSC标志物（CD44、CD73、CD105），而阴性表达内皮或造血细胞标志物（CD11b、CD34、CD45）；ADMSC则阳性表达CD29、CD44、CD90，阴性表达CD31、CD34和HLA-DR（图1）。这证实了两种细胞均符合MSC的表型特征。

其次，是动物模型建立与细胞移植。研究对象为8周龄、平均体重250克的Sprague-Dawley（SD）大鼠和裸鼠。SD大鼠用于主要疗效评估，而免疫缺陷的裸鼠则用于评估细胞存活、分化和长期效应。所有动物被随机分为四组：假手术组（Sham）、损伤后注射磷酸盐缓冲液组（PBS）、损伤后注射ADMSC组（ADMSC）和损伤后注射iMSC组（iMSC）。CNI-ED模型的建立通过暴露并钳夹双侧海绵体神经（距盆大神经节1毫米处，用止血钳钳夹120秒）来完成。治疗时，研究者将1×10^6个细胞（iMSC或ADMSC）与纤维蛋白密封剂（一种猪源纤维蛋白支架）混合，配制成20微升的悬液，然后注射入阴茎海绵体。使用纤维蛋白支架是本研究的一个方法特色，其目的在于：一是确保细胞能更准确地注入海绵体而非其周围神经区域；二是利用支架的物理特性，防止细胞被海绵体丰富的血流过快冲刷带走，从而延长其局部停留和作用时间。

第三，在治疗4周后（裸鼠为3个月），对动物进行勃起功能评估。方法是用电刺激双侧海绵体神经，通过颈动脉插管记录平均动脉压（mean arterial pressure，MAP），同时用植入的侦测针记录海绵体内压（intracavernous pressure，ICP）。勃起功能的定量指标为最大ICP（ICPmax）与MAP的比值，以及总ICP（total ICP）与MAP的比值。这些压力曲线通过BL-420S生物机能系统记录。

第四，功能评估后，收集阴茎和盆大神经节（major pelvic ganglia，MPG）组织进行一系列组织学和分子生物学检测。通过Masson三色染色评估海绵体平滑肌与胶原纤维的比例。利用免疫荧光和免疫组织化学染色，检测了阴茎组织中的内皮标志物（vWF, eNOS）、平滑肌标志物（SMA, desmin）、神经元型一氧化氮合酶（nNOS），以及MPG组织中的凋亡相关蛋白caspase-3和神经成分标志物S100β。同时，通过Western blot检测阴茎组织中nNOS、Bax、Bcl-2和caspase-3的蛋白表达水平。这些多层次的检测构成了一个完整的证据链，用以全面评估iMSC对阴茎组织结构的修复作用。

最后，为探索治疗机制，研究者在裸鼠模型中使用了PKH67荧光染料标记的iMSC和ADMSC。在移植后的第3天和第7天，利用激光共聚焦显微镜追踪细胞的存活和分布。同时，通过经典PCR和凝胶电泳，使用人特异性引物检测人源细胞在移植后第3、7、15天的存活（人GAPDH表达）和跨分化（人SMA、vWF、eNOS表达）情况。为了探究旁分泌作用，研究者在移植后第3、7、28天，通过实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测了大鼠宿主阴茎组织中一系列与修复相关的可溶性因子（VEGFA、IGF1、SDF1、STC1、NGF）的基因表达水平。

主要研究结果

研究结果表明，iMSC移植对CNI-ED模型大鼠具有显著的治疗效果。

在勃起功能恢复方面，电刺激下的ICP/MAP比值分析显示，PBS组的ICPmax/MAP和total ICP/MAP比值较假手术组显著降低，证实了ED模型的成功建立。而iMSC和ADMSC移植组，这两个比值均较PBS组有显著提升（图2），表明两种细胞均能有效改善勃起功能，且两组间的恢复程度无统计学差异。

在组织学结构修复方面，结果与功能改善高度一致。免疫组化显示，CNI导致阴茎组织内vWF和eNOS表达显著下调，而iMSC和ADMSC治疗能挽救其表达，提示内皮成分得到恢复（图3A, C）。Masson三色染色证实，iMSC和ADMSC逆转了CNI引起的平滑肌/胶原比例下降（图3B, D）。免疫荧光染色进一步证实，iMSC治疗能够显著减轻CNI导致的平滑肌细胞标志物SMA和desmin的表达缺失（图4A, D）。这些证据共同表明，iMSC在恢复阴茎内皮和平滑肌组织结构方面，效果与ADMSC相当。

在神经和抗凋亡效应方面，CNI导致阴茎背神经中nNOS表达减弱，而iMSC和ADMSC移植使其表达显著增强（图4B, C）。Western blot结果也验证了这一点（图5B, C），并揭示了其抗凋亡机制：iMSC治疗显著降低了促凋亡蛋白Bax和caspase-3的水平，并提升了抗凋亡蛋白Bcl-2的水平（图6C, F-H）。在MPG中，免疫荧光结果显示，iMSC治疗可以降低由CNI诱导的caspase-3高表达，并挽救S100β的表达（图6A, B, D, E）。这表明iMSC不仅能保护阴茎局部组织，还能对上游神经中枢（MPG）产生积极的神经保护和抗凋亡作用。

在治疗机制探索方面，裸鼠模型实验揭示了关键信息。首先，iMSC的治疗效果可长达3个月（90天），证实了其长期效应（图7A-F）。其次，PKH67标记和PCR结果显示，移植的iMSC仅在注射后3天内能在海绵体中被检测到，第7天即消失。并且，在所有时间点均未检测到人源性平滑肌或内皮细胞标志物的转录本，也未观察到PKH67标记的细胞与这些标志物共定位（图8）。这充分证明，iMSC并未通过长期存活并分化为阴茎组织细胞（即跨分化）来发挥作用。最后，旁分泌功能检测显示，在移植后第3天，iMSC组大鼠宿主自身的VEGFA、IGF1、SDF1、STC1和NGF等生长因子的表达显著上调，并且这种激活效应持久，可持续至第28天（图9）。这表明，短暂存活的iMSC是通过激活宿主的分泌组，即“打入体内”的旁分泌效应，来启动和维持长期的修复过程。

研究结论与价值

本研究首次探索了iMSC对海绵体神经损伤性ED的治疗作用。结论表明，iMSC移植能通过恢复阴茎内皮和平滑肌组织、上调nNOS表达以及抗凋亡等途径，显著改善CNI引起的勃起功能障碍。其治疗效果与传统ADMSC相当，但iMSC在临床应用上具有获取无创、扩增能力强、均一性好等显著优势，是未来细胞治疗CNI-ED的一个极具前景的候选方案。其科学价值在于，揭示了iMSC主要通过即时的旁分泌作用“唤醒”宿主自身修复能力，而非依赖其长期定植和分化来行使功能，这为理解iMSC的治疗机制提供了新见解。其应用价值在于，为解决MSC疗法中细胞来源受限和标准化困难的问题提供了可行策略，有望推动ED细胞疗法向临床转化。

研究亮点

本研究的亮点主要体现在以下几个方面：第一，研究对象的创新性，首次将iMSC应用于ED治疗领域，并证实其疗效，为传统MSC提供了一个更优的替代来源。第二，方法学的特殊性，巧妙地使用了纤维蛋白支架与细胞混合注射，这既有助于细胞在海绵体内的定位，又可能防止其被血流快速清除，是一种实用的技术改良。第三，机制探索的深度，通过裸鼠模型、人特异性标记物追踪和宿主旁分泌因子检测，清晰地将iMSC的治疗机制归结于“激活宿主旁分泌”模式，排除了长期直接分化为阴茎组织的替代机制，论证逻辑严谨。第四，临床转化前景明确，研究直接针对盆腔术后并发症这一临床痛点，并强调了iMSC突破传统MSC临床限制的潜力，为未来的临床研究奠定了坚实的基础。