关于麻醉诱导发育期神经毒性机制与生物标志物的转化研究报告
一、 研究团队与发表信息
本研究由来自美国威斯康星医学院（Medical College of Wisconsin）多个部门的科研人员合作完成。主要作者包括 Tarun Pant, Congshan Jiang, Yasheng Yan, Bailey Schultz, Daniel Laws, Sarah Logan, Amina Bedrat, Matea Juric, Richard J. Berens, Susan P. Taylor, Amy M. Henry, Ahmer Mohiuddin, Zeljko J. Bosnjak 以及通讯作者 Xiaowen Bai。该研究成果已于2025年发表在《英国麻醉学杂志》（British Journal of Anaesthesia）上。
二、 学术背景与研究目的
本研究属于发育神经毒理学与转化医学交叉领域。临床背景在于，全身麻醉对于小儿外科手术至关重要，但动物研究和部分临床观察表明，在脑发育关键期长时间或反复暴露于全身麻醉药物，可能与神经元损伤和长期认知功能缺陷相关。然而，由于伦理和技术限制，直接在发育中的人类大脑中研究麻醉诱导的神经毒性分子机制极为困难。因此，麻醉药物对发育中人脑神经毒性的具体分子通路和生物标志物仍不清楚。
为此，本研究旨在利用两种互补的人类相关模型来阐明麻醉诱导发育神经毒性的机制：1）由诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）分化而来的三维（3D）人脑类器官（cerebral organoids），该模型能重现早期人脑发育的关键特征；2）接受麻醉手术的儿科患者的血清样本，提供临床转化背景。研究假设是：麻醉暴露会破坏编码和非编码RNA信号通路，导致病理变化，从而引起发育神经毒性。通过整合高通量RNA谱分析和生物信息学，研究旨在探究信使RNA（mRNAs）和长链非编码RNA（long noncoding RNAs, lncRNAs）在介导麻醉相关神经毒性中的作用，并寻找在类器官和患者血清中均可检测到的共享分子特征，以作为潜在的转化生物标志物和治疗靶点。
三、 详细研究流程
本研究采用了一个整合的、多步骤的实验流程，结合了体外类器官模型和临床样本分析。
流程一：人脑类器官的构建与表征 首先，研究团队使用健康供者来源的iPSC系，通过已建立的方案生成了三维人脑类器官。这些类器官经过60天的分化培养。研究通过逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测了不同时间点（第0、20、30、60天）神经相关基因的表达，证实了类器官随时间发育，并包含多种脑细胞类型。免疫荧光染色进一步确认了第60天的类器官中存在神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞和平滑肌细胞的标记物。因此，研究选择第60天的成熟脑类器官用于后续麻醉暴露实验。
流程二：麻醉药物暴露与类器官病理评估 研究选用儿科麻醉中常用的静脉麻醉药丙泊酚（propofol）进行处理。为模拟临床不同暴露场景，设置了两种处理方案：1）单次暴露：使用10 μg/mL丙泊酚处理1、2、3或6小时，模拟短时或长时间手术麻醉；2）重复暴露：连续3天，每天使用5或10 μg/mL丙泊酚处理1或2小时，模拟短期内多次麻醉暴露。使用二甲基亚砜（DMSO）作为溶剂对照。 随后，研究评估了丙泊酚诱导的病理变化。通过酶活性测定检测了细胞凋亡标志物半胱天冬酶-3（caspase-3）的活性。通过蛋白质印迹法（Western blot）检测了自噬标志物LC3B I/II的比率，并通过电子显微镜观察了自噬体的形成。这些实验确定了丙泊酚暴露（单次10 μg/mL 6小时或重复暴露）能显著增加类器官的凋亡和自噬水平。
流程三：类器官转录组学与生物信息学分析 为了深入探究分子机制，研究对经丙泊酚（10 μg/mL，6小时）或对照处理的第60天类器官进行了全基因组微阵列分析。该分析覆盖了18,855个编码RNA（mRNAs）和27,427个长链非编码RNA（lncRNAs）。通过生物信息学工具对差异表达的RNA进行深入分析： 1. 通路分析：使用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）软件对553个差异表达mRNAs进行经典通路和疾病功能富集分析，发现这些基因与炎症、线粒体功能、应激反应、细胞损伤修复以及神经系统疾病等通路相关。 2. 特定基因集分析：利用Syngo、MitoXplorer和美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库，分别从差异表达基因中筛选出与突触功能、线粒体功能和炎症相关的特定基因集（分别为44、39和23个基因），并进一步分析这些基因集的功能和关联网络。 3. lncRNA-mRNA共表达网络分析：针对792个差异表达的lncRNAs，计算它们与上述突触、线粒体、炎症相关mRNAs之间的相关系数，并使用Cytoscape软件构建共表达调控网络，以揭示lncRNAs可能参与的调控机制。
流程四：类器官蛋白与功能验证 基于转录组学结果，研究进行了多项验证实验：1）通过蛋白质印迹法检测突触完整性标记物PSD95和神经元活动标记物c-Fos的蛋白表达水平；2）通过电子显微镜观察线粒体超微结构；3）使用化学发光法测定细胞内三磷酸腺苷（ATP）浓度；4）通过蛋白质印迹法验证线粒体相关基因CKMT1B（线粒体肌酸激酶1B）的蛋白表达变化。这些实验从蛋白质和功能层面证实了转录组学发现的可靠性。
流程五：儿科患者血清样本收集与分析 作为平行的临床模型，研究收集了年龄小于4岁的儿科患者（每组n=10）在接受短时（<1小时）或长时间（>3小时）麻醉手术前后的血清样本。麻醉方案包括丙泊酚、氯胺酮、异氟烷或七氟烷。 首先，通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测了血清中脑损伤或应激的标志物蛋白水平：脑源性神经营养因子（BDNF）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）和S100钙结合蛋白B（S100b）。 其次，对长时间麻醉（>3小时）患者手术前后的血清样本同样进行了全转录组微阵列分析，以检测差异表达的mRNAs和lncRNAs。随后，利用已发表的单细胞转录组数据集，将血清中差异表达的mRNAs映射到特定的脑细胞类型（神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞），以推断其可能的细胞来源。
流程六：跨模型数据整合分析 这是本研究的关键创新步骤。研究将类器官模型和患者血清模型的转录组数据进行了交叉比对，旨在发现共同的、与麻醉神经毒性相关的分子特征。具体包括：1）识别在类器官和患者血清中共同出现差异表达的mRNAs和lncRNAs；2）对这些重叠基因进行通路富集分析（使用IPA和Metascape平台）；3）分析重叠的lncRNAs与mRNAs之间的共表达关系，构建潜在的调控网络。
四、 主要研究结果
结果一：丙泊酚诱导人脑类器官产生剂量、时长和频率依赖性的细胞损伤。 实验数据显示，单次丙泊酚（10 μg/mL）暴露6小时或重复暴露均能显著增加类器官中caspase-3活性（凋亡标志）和LC3B I/II比率（自噬标志）。电子显微镜观察到了自噬体的形成。这验证了类器官模型对麻醉神经毒性的敏感性，并为后续分子机制研究奠定了基础。
结果二：转录组学揭示丙泊酚广泛干扰与神经发育和功能相关的基因网络。 微阵列分析显示，丙泊酚处理导致类器官中553个mRNAs和792个lncRNAs表达失调。通路分析表明，这些差异基因富集于突触功能、线粒体活动、炎症、细胞损伤和神经系统疾病等关键通路。特别是，发现了44个与突触相关的差异基因（如CALB2, ATP2B4, NRP2）和39个与线粒体相关的差异基因。
结果三：丙泊酚损害突触完整性和线粒体功能。 验证实验证实：1）突触后支架蛋白PSD95和神经元活动标记c-Fos的蛋白表达显著下降，表明突触发生和神经元反应性受损；2）电子显微镜显示线粒体出现肿胀、嵴结构破坏等超微结构异常；3）细胞内ATP浓度显著降低；4）线粒体肌酸激酶CKMT1B在mRNA和蛋白水平均下调。这些结果将转录组变化与具体的细胞功能缺陷联系起来，首次提出了线粒体能量代谢障碍（以CKMT1B下调为代表）与突触功能受损之间存在关联的新机制。
结果四：丙泊酚暴露导致lncRNAs表达谱广泛改变，并与关键mRNAs形成共表达网络。 研究发现462个lncRNAs下调，330个上调。共表达网络分析显示，这些差异lncRNAs与突触、线粒体和炎症相关的差异mRNAs显著相关，提示lncRNAs可能通过调控这些蛋白编码基因参与麻醉神经毒性的发生。这是首次在人类相关脑模型中报道麻醉剂对lncRNAs表达的影响。
结果五：长时间麻醉导致儿科患者血清脑损伤标志物改变。 临床样本分析显示，与短时麻醉组相比，接受超过3小时麻醉的患儿术后血清中，损伤性标志物NSE和S100b浓度显著升高，而保护性神经营养因子BDNF浓度显著降低。这表明长时间麻醉/手术可能与系统性脑损伤应激反应相关。
结果六：患者血清转录组揭示与脑细胞类型特异性损伤相关的RNA特征。 对长时间麻醉患者血清的微阵列分析发现了1492个差异mRNAs和2809个差异lncRNAs。通过生物信息学映射，从中识别出116个可能与特定脑细胞类型（神经元、胶质细胞、内皮细胞）相关的mRNAs，其功能富集于轴突发生、髓鞘形成、神经炎症等通路，提示血清RNA可能反映中枢神经系统特定细胞的损伤状态。
结果七：类器官与患者血清模型共享关键的差异表达分子。 跨模型整合分析是本研究最重要的发现之一。尽管存在生物学差异，但研究成功鉴定出21个在两类模型中共同差异表达的mRNAs和12个共同差异表达的lncRNAs。这21个重叠mRNAs中，包含2个突触相关基因（ACTN1, PTPRN2）和1个线粒体基因（CKMT1B）。值得注意的是，CKMT1b在类器官中也被证实蛋白表达下调且伴随ATP减少。此外，12个重叠lncRNAs中有7个与11个重叠mRNAs存在强共表达关系，形成了一个与细胞损伤、神经发育和认知相关的调控网络。这些共享分子特征，尤其是CKMT1B，作为连接体外机制与临床表型的桥梁，具有极高的转化潜力。
五、 研究结论与价值
本研究通过整合人脑类器官和儿科患者血清两种人类相关模型，系统揭示了麻醉诱导发育神经毒性的多层面分子机制，并识别了潜在的转化生物标志物。
结论：丙泊酚暴露通过诱导线粒体功能障碍（结构损伤、ATP减少、CKMT1B下调）、破坏突触完整性（PSD95、c-Fos下调）以及引发炎症反应，导致发育中的人脑神经网络损伤。这种损伤伴随着编码RNA（mRNAs）和非编码RNA（lncRNAs）表达网络的广泛失调。在临床层面，长时间麻醉与血清脑损伤标志物改变及特定的循环RNA特征相关。最重要的是，研究发现了在类器官和患者血清中重叠的分子特征（如CKMT1B），这些特征可作为连接基础研究与临床应用的“桥梁”。
价值： 1. 科学价值：首次在人类3D脑类器官模型中全面描绘了麻醉剂对lncRNAs表达谱的影响，并建立了lncRNA-mRNA共表达调控网络在麻醉神经毒性中的作用框架。提出了“线粒体-突触轴”作为发育期麻醉神经毒性核心机制的新见解。 2. 转化医学价值：为开发基于血清的生物标志物（如蛋白质BDNF/NSE/S100b， RNA如CKMT1B及特定lncRNAs）提供了直接证据，可用于无创评估儿科患者麻醉相关神经损伤风险。同时，识别出的关键分子如CKMT1B、PSD95及相关lncRNAs，为开发新型干预策略（如线粒体稳定剂、抗炎药、RNA靶向疗法）提供了潜在的分子靶点。 3. 方法论价值：建立并验证了“人脑类器官+临床血清组学”的双模型整合研究范式，为研究其他无法在体直接观察的人类发育性神经系统疾病或药物毒性提供了可借鉴的方法学框架。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
研究也坦诚地指出了局限性：1）类器官与血清属于不同生物学 compartment，血脑屏障的存在可能导致两者共享的差异基因数量有限；2）临床血清样本来源于接受麻醉和手术的患儿，手术创伤本身是一个混杂因素；3）临床样本量（每组10例）相对较小。作者提出，未来需要在更大规模的独立患者队列中进行纵向研究，以验证这些生物标志物的可靠性并探索其与长期神经发育结局的关联。这些讨论体现了研究的严谨性，并为后续研究指明了方向。