基于时空梯度水凝胶的血管化骨类器官构建及其在临界尺寸颅骨缺损修复中的应用研究

第一作者及单位
本研究的通讯作者包括Jianhua Wang（上海交通大学医学院附属新华医院骨科）、Long Bai（上海大学转化医学研究院类器官研究中心）和Jiacan Su（上海大学转化医学研究院类器官研究中心）。合作单位涵盖上海交通大学医学院附属第六人民医院骨质疏松与骨病科、上海大学医学院、温州研究院等。研究发表于Composites Part B期刊，2025年4月在线发表（Volume 302, 112553）。

学术背景
本研究属于骨组织工程与再生医学领域，聚焦于解决骨类器官（bone organoids）临床转化中的核心瓶颈——血管化不足问题。传统骨修复材料（如自体/异体移植物）存在来源有限和免疫排斥风险，而现有组织工程策略难以模拟天然骨组织的复杂微环境。骨类器官技术通过三维（3D）结构整合细胞、基质和信号分子，可高度模拟天然骨组织的形态与功能，但其规模化应用受限于大体积细胞聚集体内血管网络的形成。本研究旨在开发一种时空梯度水凝胶系统，通过顺序性血管-成骨偶联（sequential angiogenic-osteogenic coupling）策略，实现血管化骨类器官的功能化构建，并应用于临界尺寸颅骨缺损修复。

研究流程与方法
1. 材料设计与制备
- 水凝胶系统构建：采用明胶甲基丙烯酰（GelMA）作为外基质，包裹间充质干细胞（BMSCs）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs），并负载促血管因子二甲氧基甘氨酸（DMOG）；内部嵌入丝素蛋白（SilMA）微球，负载纳米羟基磷灰石（nHAp）。
- 微球制备：通过微流控技术制备SilMA微球（MSS）和nHAp负载微球（H-MSS），优化流速比（水相8 μL/min，油相80 μL/min）和紫外交联条件（365 nm, 80 mW/cm²）。
- 表征实验：通过扫描电镜（SEM）、能谱分析（EDS）和流变学测试验证材料形貌、元素分布及力学性能。结果显示，H-MSS粒径（518.78 ± 18.96 μm）大于MSS（418.93 ± 18.26 μm），且nHAp的掺入降低了压缩强度（H-MSS峰值力181.9 μN vs. MSS的4231 μN）。

1. 体外功能验证

   • 细胞共培养：将BMSCs与HUVECs以1:1比例共封装于水凝胶中，动态培养21天。活死染色显示细胞存活率>90%，细胞骨架染色证实细胞均匀分布且形态伸展。
     
   • 成骨与血管化评估：
     
     • 碱性磷酸酶（ALP）和茜素红（ARS）染色显示，HSBHD-Gel组（含nHAp和DMOG）的ALP活性（第7天）和钙沉积（第14天）显著高于对照组（p < 0.01）。
       
     • Western blot检测成骨标志物（BMP-2、Runx2、OCN）和血管化标志物（CD31、VEGF-A、HIF-1α），证实HSBHD-Gel组蛋白表达量最高。
       
   • 转录组分析：RNA-seq揭示BMSCs中2385个差异基因（如MAPK、Wnt通路富集），HUVECs中214个差异基因（如PI3K-Akt、HIF-1通路富集），支持成骨-血管化协同调控机制。

2. 体内实验

   • 皮下异位成骨模型：将材料植入裸鼠背部，4周后Micro-CT显示HSBHD-Gel组新生骨体积（BV/TV）较对照组提高3.2倍（p < 0.001），免疫组化证实COL1A1和CD31表达显著增强。
     
   • 颅骨缺损模型：在C57BL/6小鼠中制造3 mm临界尺寸缺损，植入HSBHD-BO（体外预培养21天的血管化骨类器官）。术后8周，Micro-CT显示缺损覆盖率达82.5%，骨密度（BMD）较对照组提高4.1倍（p < 0.0001），组织学显示成熟骨小梁和功能化血管网络形成。

主要结果
1. 时空梯度释放机制：GelMA快速降解（56天降解率97.76%）促进DMOG早期释放，驱动血管生成；SilMA缓慢降解（56天降解率24.79%）实现nHAp的持续释放，引导成骨分化。
2. 血管-成骨偶联效应：DMOG通过稳定HIF-1α上调VEGF，促进HUVECs形成管腔结构；nHAp通过钙磷离子释放激活BMSCs的Runx2/BMP-2通路，协同增强骨基质矿化。
3. 类器官功能验证：HSBHD-BO在体外显示ALP活性（提高2.8倍）和钙结节（提高3.5倍）的显著增强；体内修复颅骨缺损时，新生骨与宿主骨无缝整合，血管密度提高4.7倍。

结论与价值
1. 科学价值：首次提出“时空梯度水凝胶”策略，解决了骨类器官血管化与营养供应的动态平衡难题，为复杂组织工程提供了新范式。
2. 应用价值：该技术可拓展至大体积骨缺损修复、个性化疾病模型构建及药物筛选平台开发。
3. 临床意义：通过功能化血管网络与骨基质的同步重建，为临界尺寸骨缺损的临床治疗提供了可行方案。

研究亮点
1. 创新方法：结合微流控技术与双水凝胶系统，实现血管化与成骨的时空精确调控。
2. 多组学验证：通过转录组、蛋白组和影像学多维度证实成骨-血管化协同机制。
3. 转化潜力：体内实验证实颅骨缺损的完全修复，优于传统静态支架（骨再生量提高4.1倍）。

其他价值
研究建立的SilMA/GelMA复合体系可适配其他生长因子或细胞类型，为多组织类器官（如软骨-骨复合体）的构建提供通用平台。