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脑缺血引发系统性Notch1活性驱动动脉粥样硬化的研究

本研究的主要作者为Mingming Liu、Danni Wang和Caiyun Qi，通讯作者为Jie Zhou、Ding Ai以及Qiang Liu。该研究由天津医科大学总医院神经病学研究所、免疫学研究所、实验血液学国家重点实验室等机构完成，并发表于2024年9月10日的《Immunity》期刊上。

研究背景

脑卒中（中风）是全球范围内致死率和致残率极高的疾病之一，其复发风险尤其值得关注。研究表明，卒中后患者全身血管系统的炎症反应加剧，这可能与动脉粥样硬化（atherosclerosis）的进展密切相关。然而，关于卒中如何诱导全身血管内皮细胞（endothelial cells, ECs）的持续激活及其具体机制尚不清楚。Notch信号通路在调控细胞间通讯和内皮功能方面具有重要作用，但其在卒中后的病理过程中的作用尚未被充分揭示。因此，本研究旨在探讨卒中是否通过Notch1信号通路诱导全身性内皮细胞的持续激活，并进一步促进动脉粥样硬化的发生和发展。

研究方法与流程

本研究分为多个步骤进行，详细描述如下：

1. 数据收集与分析

研究人员首先利用中国国家卒中登记数据库（China National Stroke Registry, CNSR-III）的数据，分析了10,348名卒中患者的复发率及死亡原因。结果表明，在卒中后前三个月内，由大动脉粥样硬化引起的卒中复发率为9.7%，而心源性栓塞和小血管闭塞分别为7.8%和4.5%。此外，研究还使用微正电子发射断层扫描（micro-PET）和计算机断层扫描（CT）技术检测了实验性卒中小鼠主动脉中18F-氟脱氧葡萄糖（18F-FDG）的摄取情况，发现卒中后主动脉区域的细胞活性显著增加。

2. 内皮细胞单细胞RNA测序

为了进一步了解卒中对内皮细胞的影响，研究人员从假手术组和卒中模型组小鼠的主动脉组织中分离出CD31+内皮细胞，并进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。通过对22,055个细胞进行图聚类（graph-based clustering）和均匀流形近似与投影（UMAP），研究人员识别出三个主要的内皮细胞簇（clusters）。其中，Cluster 1表现出高水平的VCAM1（血管细胞黏附分子1）表达，且与Notch信号通路的激活密切相关。

3. 循环外泌体的分离与鉴定

研究人员从卒中小鼠和对照组小鼠的血浆中提取循环外泌体，并通过透射电子显微镜（TEM）和纳米颗粒追踪分析（NTA）对其形态和大小进行表征。随后，使用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测了外泌体表面DLL1（Delta-like ligand 1）和Jagged1的表达水平，发现卒中后这些配体的表达显著升高。此外，研究人员还通过成像流式细胞术（imaging cytometry）验证了P2RY12+CX3CR1+细胞（髓系细胞）是循环外泌体的主要来源。

4. 功能实验与机制验证

为了验证Notch1信号通路在卒中后内皮细胞激活中的作用，研究人员将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）与卒中患者或健康对照者的循环外泌体共培养，观察到Notch1、VCAM1及衰老标志物p16和p53的表达显著上调。此外，使用抗Notch1单克隆抗体（mAb）阻断Notch1信号后，上述效应被完全消除。进一步的研究还发现，抑制VCAM1能够显著减少THP-1细胞（一种人类单核细胞白血病细胞系）与HUVECs的黏附，从而降低动脉粥样硬化的进展。

5. 动物模型实验

研究人员构建了ApoE−/−小鼠（易感动脉粥样硬化的小鼠模型）并结合高脂饮食喂养，评估了Notch1信号通路在卒中后动脉粥样硬化进展中的作用。结果显示，卒中显著增加了ApoE−/−小鼠的动脉粥样硬化斑块面积和单核细胞浸润，而抗Notch1 mAb或抗VCAM1 mAb治疗则有效缓解了这些病理变化。

主要结果

1. 卒中诱导内皮细胞的持续激活与衰老
   卒中后，外周血管内皮细胞表现出持续的Notch1信号激活，并伴随VCAM1表达上调及衰老标志物（如p16和p53）的增加。这些变化至少持续至卒中后4周。

2. 循环外泌体的作用
   卒中后，循环外泌体中DLL1和Jagged1的表达显著升高，且这些外泌体主要来源于P2RY12+CX3CR1+细胞。外泌体通过激活Notch1信号通路，诱导内皮细胞的衰老样表型和促炎状态。

3. Notch1与VCAM1的功能验证
   抑制Notch1或VCAM1能够显著减少单核细胞与内皮细胞的黏附，从而缓解卒中后动脉粥样硬化的进展。

4. 动物模型验证
   在ApoE−/−小鼠模型中，卒中显著促进了动脉粥样硬化斑块的生长和炎症反应，而抗Notch1 mAb或抗VCAM1 mAb治疗则有效逆转了这些病理变化。

结论与意义

本研究揭示了卒中通过Notch1信号通路诱导全身性内皮细胞激活和衰老的新机制，阐明了循环外泌体在这一过程中的关键作用。研究结果不仅加深了对卒中后动脉粥样硬化进展的理解，还为开发针对Notch1或VCAM1的新型治疗策略提供了理论依据。此外，研究中采用的单细胞RNA测序技术和循环外泌体分析方法为相关领域的研究提供了新的工具和思路。

研究亮点

1. 重要发现：卒中通过循环外泌体中的DLL1和Jagged1配体激活Notch1信号通路，诱导内皮细胞的衰老和促炎状态。
2. 方法创新：首次结合单细胞RNA测序和循环外泌体分析，揭示了卒中后全身性内皮细胞激活的具体机制。
3. 应用价值：抗Notch1或抗VCAM1治疗有望成为预防卒中后动脉粥样硬化复发的有效手段。

其他有价值的内容

研究还探讨了HMGB1（高迁移率族蛋白B1）在卒中后全身性炎症反应中的潜在作用，尽管其受体AGER的表达未见显著变化，但HMGB1仍可能是卒中后血管炎症的重要调节因子。未来的研究可进一步探索其他“警报素”（alarmins）在卒中后病理过程中的作用。