基因编辑领域迎来重大突破：新型碱基编辑器ACBEMax实现嘌呤和嘧啶同步替换

主要作者及机构
本研究的通讯作者为华东师范大学的Ming Zhu（mzhu@bio.ecnu.edu.cn）和中国农业大学的Sen Wu（swu@cau.edu.cn）、Xuguang Du（xuguangdu@cau.edu.cn）。研究团队来自中国农业大学生物科学学院、三亚研究院、华东师范大学生物医学研究所以及杭州湘湖实验室。研究成果于2025年9月18日发表于《Cell Chemical Biology》（Volume 32, Issue 1-14）。

学术背景
遗传突变与人类疾病、农作物性状及蛋白质功能密切相关，但绝大多数单核苷酸变异（SNV）和多核苷酸变异（MNV）的性状关联机制尚未阐明。传统碱基编辑器如胞嘧啶碱基编辑器（CBE, Cytosine Base Editor）和腺嘌呤碱基编辑器（ABE, Adenine Base Editor）仅能实现单一碱基类型的转换（如C→T或A→G），且无法产生颠换突变（如A→C/T或C→G/A），严重限制了饱和突变筛选的深度。

为此，研究团队开发了名为ACBEMax的新型多碱基编辑器，通过整合双功能脱氨酶TADdual、工程化糖苷酶（MPG）和DNA修复修饰蛋白HMCEs，首次实现了哺乳动物细胞内A、C、G三种碱基的同步替换，为基因型-表型关联研究和蛋白质定向进化提供了革命性工具。

研究设计与实验流程
1. ACBEMax的模块化设计
- 核心架构：将双功能脱氨酶TADdual（可同时作用于A和C碱基）、工程化N-甲基嘌呤DNA糖苷酶（eMPG）与ncCas9(D10A)融合，并加入HMCEs蛋白的SOS响应相关肽酶域（SRAP）以降低DNA双链断裂（DSB）风险。
- 迭代优化：测试了5种版本（ACGbeV1-V5），最终选择编辑效率达70.06%、插入缺失率（indel）仅5.81%的ACGbeV5（即ACBEMax）。
- 编辑窗口：在sgRNA间隔序列的第3-10位（+3至+10）效率最高，平均A/G/C编辑效率分别为22.4%、14.3%、20.4%。

1. 体内外突变谱验证

   • 体外实验：在HEK293T、Hela和HU7细胞中测试了41个内源性基因组位点，发现ACBEMax可产生12种碱基替换类型，包括：
     
     • A→G（78.3%）、A→C（12.5%）、A→T（9.2%）
       
     • C→T（68.7%）、C→G（24.3%）、C→A（7.0%）
       
     • G→C（50.8%）、G→T（40.3%）、G→A（8.9%）
       
   • 氨基酸突变分析：在30个蛋白编码位点中，ACBEMax平均产生53.9%的氨基酸突变，覆盖37.68%的可能突变类型，其中苏氨酸（T）最易被替换（18.5%），丙氨酸（A）是最常见的新氨基酸。
     

2. 功能性筛选验证

   • 体外筛选（HPRT基因）：在人类HHL-5细胞中，通过ACBEMax诱导HPRT基因突变并筛选6-硫鸟嘌呤（6-TG）抗性变异体，鉴定出p.C66R、p.G70K等5个已知耐药突变。
     
   • 体内筛选（CTNNB1基因）：通过小鼠尾静脉水动力注射ACBEMax和CTNNB1靶向sgRNA，在肝脏中诱发肿瘤，发现已知致癌突变p.D32G和新突变p.L63V。后者通过激活Wnt通路（SOX9、c-Myc表达上调）显著增强细胞增殖、迁移和侵袭能力。
     

结果与发现
1. 多碱基编辑优势
- 与传统编辑器相比，ACBEMax在每个sgRNA位点产生的突变等位基因数量中位数达36个（ABE/CBE仅14-15个），氨基酸突变类型中位数18种（ABE/CBE仅7-9种）。
- 通过碱基切除修复（BER）和跨损伤合成（TLS）通路协同作用，实现了复杂突变谱的生成。敲除UNG2可提高C→T纯度，而敲除REV1则显著减少颠换突变。

1. 脱靶效应控制

   • DNA层面：追踪测序（Tracking-seq）显示，ACBEMax的Cas9依赖性脱靶率低于ABE/CBE，且正交R环实验证实其Cas9非依赖性脱靶效应更低。
     
   • RNA层面：RNA测序发现ACBEMax引起的A-to-I（腺苷-to-肌苷）编辑效率低于内源ADAR酶活性。
     

2. 应用验证

   • 定向进化：在HPRT筛选中，ACBEMax成功富集到临床相关的耐药突变。
     
   • 致癌机制：CTNNB1 p.L63V突变通过核定位增加和Wnt通路激活驱动肝癌发生，为靶向治疗提供新靶点。
     

研究意义
1. 科学价值：ACBEMax突破了传统编辑器仅能产生过渡突变（嘌呤↔嘌呤或嘧啶↔嘧啶）的限制，首次实现了哺乳动物细胞内嘌呤与嘧啶的同步替换，填补了饱和突变筛选的技术空白。
2. 应用前景：
- 功能基因组学：高通量解析SNV/MNV的生物学功能
- 疾病建模：快速构建携带复杂突变的动物模型
- 蛋白质工程：无需构建文库即可实现单残基分辨率定向进化

研究亮点
1. 技术创新：首创双脱氨酶-糖苷酶融合架构，整合HMCEs降低indel率
2. 编辑广度：单次编辑可产生12种碱基替换和超过37%的氨基酸突变覆盖
3. 临床关联：发现CTNNB1 p.L63V这一未报道的致癌突变并解析其机制

局限性与展望
目前ACBEMax的PAM依赖性和突变偏好性仍待优化，未来可通过融合SpG-Cas9变体扩展靶向范围。该研究为开发下一代“全碱基编辑器”奠定了基础。