类型a：单一原创研究学术报告
一、研究概述与发表信息
本研究由江南大学（Jiangnan University）食品科学与资源国家重点实验室及食品科学与技术学院的赵申熙（Shenxi Zhao）、陈家俊（Jiajun Chen）、魏宇涵（Yuhan Wei）、徐伟（Wei Xu）、张文立（Wenli Zhang）、倪大伟（Dawei Ni，通讯作者）及沐万孟（Wanmeng Mu）共同完成。该研究成果于2025年4月30日在线发表于国际学术期刊《International Journal of Biological Macromolecules》（第311卷，文章号143722）。
二、研究背景与目的
在食品工业领域，甜味剂是日常饮食中不可或缺的组成部分。传统的蔗糖和高果糖玉米糖浆（HFCS）虽然能提供体积和口感，但因其高热量特性，促使消费者寻求更健康的低热量替代品。稀有糖（Rare sugars）因其极低的天然含量和难以被人体消化的特性，成为新型低热量甜味剂的重要选择。其中，D-塔格糖（d-tagatose）具有蔗糖92%的相对甜度但仅38%的热量，并已在2001年获得美国食品药品监督管理局（FDA）的普遍认为安全（GRAS）认证。除了优良的低热量特性外，D-塔格糖还具有调节肠道菌群、低血糖指数、调节血脂、抗氧化和抗龋齿等多种生理功能。
然而，D-塔格糖的商业化应用受限于其生产成本。传统生产方法主要依赖于L-阿拉伯糖异构酶（l-arabinose isomerase, l-AIase）催化昂贵的D-半乳糖异构化，而D-半乳糖仅能通过乳糖水解大规模获得，成本远高于果糖。近年来，利用单一酶从低成本的D-果糖生产D-塔格糖的路径被开发出来，其中D-塔格糖4-差向异构酶（tagatose 4-epimerase, T4Ease）成为关键酶种。本研究旨在从高温蛋白古菌（Thermoprotei archaeon）中鉴定一种新型的T4Ease，全面解析其酶学性质，并通过优化其在大肠杆菌（Escherichia coli）中的表达，探索基于全细胞生物转化的高效D-塔格糖生产工艺。
三、研究方法的详细流程
1. 基因挖掘与序列分析 研究团队从宏基因组组装基因组（MAG）中发现了来自高温蛋白古菌的假设蛋白DRJ43_04605，并将其命名为DRJ43-T4Ease。通过氨基酸序列比对发现，该酶与另一高温蛋白古菌T4Ease（DRJ37_03570）约有67%的序列同一性，但与其他已报道的T4Ease（如来自热袍菌属Thermotoga species的酶）的同一性不足30%。利用AlphaFold数据库获取了DRJ43-T4Ease的三维结构模型，通过与已知晶体结构的Cohnella laeviribosi UXAE（PDB号6ILB）进行结构比对，确认其活性位点中包含两个保守的催化残基（Glu60和Asp108）以及两个负责金属离子结合的关键组氨酸（His109和His326）。
2. 重组酶的构建、表达与纯化 将编码DRJ43-T4Ease的基因序列C端融合6×组氨酸标签（6× histidine tag），并克隆至pET-28a(+)载体的Nde I和Xho I酶切位点。将重组质粒转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞中，在含有卡那霉素（kanamycin）的LB培养基中进行培养。当OD600达到约0.6时，加入0.5 mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），在25°C下诱导表达12小时。通过离心收集细胞，超声破碎后，利用镍离子亲和层析（Ni-affinity chromatography）纯化带有组氨酸标签的重组蛋白，最后通过透析去除咪唑及EDTA-2Na。
3. 分子量测定与结构解析 采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定亚基分子量约为55 kDa，与理论值58.9 kDa相符。通过高效液相色谱（HPLC）凝胶过滤层析法，使用TSKgel G3000SWXL色谱柱，以甲状腺球蛋白（670 kDa）、γ-球蛋白（150 kDa）、鸡卵清蛋白（44.3 kDa）和核糖核酸酶A（13.7 kDa）为标准品进行校准。测得全酶分子量约为98.2 kDa，提示该酶在溶液中以同源二聚体（homodimeric）形式存在。
4. 酶学性质表征 酶活测定体系以10 g/L的D-果糖为底物，在50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）和1 mM NiSO₄存在下进行。反应在90°C下进行30分钟，加入盐酸至100 mM终止反应，利用HPLC配示差折光检测器和Waters Sugar-Pak I色谱柱进行产物检测。
在pH依赖性研究中，使用三种缓冲液（PIPES：pH 6.5-7.5；EPPS：pH 7.5-8.5；Tris-HCl：pH 8.0-9.0）在90°C下测定，发现最适pH为7.5（PIPES缓冲液）。在温度梯度（60–95°C）研究中，最适温度确定为90°C，在80°C以上保持了超过50%的相对活性。金属离子特异性实验中，测试了七种金属离子（Cu²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Mg²⁺，均为1 mM），结果表明Ni²⁺的激活效果最为显著，其活性是无金属离子添加时的约10倍，Co²⁺仅达到Ni²⁺条件下活性的36%。在最适条件下（pH 7.5，90°C，1 mM Ni²⁺），酶的比活性（specific activity）为0.79 U/mg。
热稳定性研究将纯化酶分别置于85°C、90°C和95°C下孵育，定时取样测定残余活性。利用一级失活方程计算半衰期（half-life, t₁/₂），在85°C、90°C和95°C下的半衰期分别为7.19小时、6.56小时和4.84小时。利用纳米差示扫描量热仪（Nano DSC）测得其变性温度（melting temperature, Tm值）高达105.9°C。
5. 动力学参数测定 以不同浓度（5-500 mM）的D-果糖和D-塔格糖为底物，测定初始反应速率。利用OriginPro软件进行非线性回归分析，拟合米氏方程。对于底物D-果糖，米氏常数（Km）为51.86 mM，转换数（kcat）为127.22 min⁻¹，催化效率（kcat/Km）为2.45 mM⁻¹ min⁻¹。对于D-塔格糖，Km为39.92 mM，kcat为174.88 min⁻¹，kcat/Km为4.38 mM⁻¹ min⁻¹，表明该酶对D-塔格糖的底物特异性更高。
6. 翻译起始序列优化以增强表达 为提高DRJ43-T4Ease在E. coli中的表达量，研究人员对翻译起始效率进行了优化。依据近期研究提出的“密码子3-5位（对应核苷酸7-15位）的氨基酸组成是决定翻译效率的关键限速步骤”这一理论，特别是“KYQ”残基序列能显著增强蛋白质合成的发现，构建了两种重组质粒。第一种（pET-DRJ43-T4Ease-M1）将DRJ43-T4Ease的第3至第5个氨基酸残基替换为KYQ；第二种（pET-DRJ43-T4Ease-M2）则在原始序列前两位氨基酸之后直接插入了KYQ序列。这两种质粒分别转化E. coli BL21(DE3)，获得工程菌株ECDRJ43-T4Ease-M1和ECDRJ43-T4Ease-M2。通过在TB培养基中于25°C摇瓶发酵24小时，收集细胞并进行超声破碎。SDS-PAGE分析和发酵体积活性（fermentation volume activity）测定结果显示，ECDRJ43-T4Ease-M1的发酵体积活性达到98.4 U/L，是原始菌株的1.78倍。
7. 生物转化生产D-塔格糖 纯酶催化实验使用4 mg/mL的纯化DRJ43-T4Ease，在80°C、pH 7.5条件下转化100 g/L的D-果糖，5分钟内转化率即达到16.8%，30分钟时D-塔格糖的最高产率达到21.7%。全细胞转化实验将6 mL工程菌株ECDRJ43-T4Ease-M1的发酵液离心后，将收集的细胞重悬于1 mL反应体系中（此时OD600约为84）。当以100 g/L D-果糖为底物转化9小时后，D-塔格糖的产率最高达到了17.2%。当将底物浓度提高至300 g/L时，9小时后D-塔格糖的产量为34.4 g/L，对应的转化率为11.47%。
四、主要结果及其逻辑关系
研究首先通过序列比对证实DRJ43-T4Ease属于一个低同源性的新型差向异构酶分支，其关键的催化残基和金属结合位点高度保守，这为其功能鉴定提供了结构基础。随后的酶学性质表征揭示了该酶的核心优势：极高的热稳定性（Tm值105.9°C，90°C下半衰期6.56小时）和严格的Ni²⁺依赖性。这些特性为其在工业规模的高温反应器中长期稳定运行提供了保障。动力学参数分析进一步量化了其催化优势，其催化效率远优于未改造的热袍菌属UXAE，甚至优于经过多轮定向进化的工程酶。
基于优良的酶学特性，研究进入了应用转化阶段。翻译起始序列优化实验是实现工业应用的关键环节。通过引入“KYQ”序列替换密码子3-5位，成功将目标蛋白的表达量提升了78%，证明了利用翻译起始调控增强稀有酶在E. coli中表达的策略是有效的。最后，全细胞转化实验验证了这一表达系统的实用性。使用高密度细胞（OD600≈84）转化反应，在9小时内获得了17.2%的转化率，并证明了在高底物浓度（300 g/L）下的可行性，这为后续利用廉价、粗制的底物进行连续化大规模生产奠定了坚实基础。
五、研究结论与价值
本研究成功鉴定了一种来源于高温蛋白古菌的新型D-塔格糖4-差向异构酶（DRJ43-T4Ease），并对其酶学性质及生产应用潜力进行了系统性评估。结论指出，该酶具备极高的热稳定性和对D-果糖卓越的催化效率，是目前同类酶中催化效率最高的。通过优化翻译起始序列，构建的工程化大肠杆菌实现了酶的高效表达，并成功建立了一种以低成本D-果糖为底物的全细胞生物转化生产体系。
该研究的科学价值在于，它发现并表征了一个性质超越已报道的野生型和工程化T4Ease的优异新酶种，进一步拓展了人们对糖差向异构酶家族结构与功能关系的认知。其应用价值则体现在为D-塔格糖的工业化生产提供了一条颠覆性的技术路线——以廉价的D-果糖替代昂贵的D-半乳糖作为底物，绕过了传统乳糖水解步骤，大幅降低了原料成本。这种基于单一酶的高温全细胞催化工艺，具有流程短、效率高、稳定性强的特点，为实现D-塔格糖这一高端功能性甜味剂的市场普及清除了关键的成本障碍。
六、研究亮点