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作者及机构

本研究由Mark Kokoris（通讯作者，Roche Sequencing Solutions, Seattle WA, USA；Stratos Genomics, Inc.联合创始人及前CEO）领衔，联合来自Roche Sequencing Solutions和Stratos Genomics的30余位研究者共同完成。论文以预印本形式发布于bioRxiv，发布于2025年2月24日，DOI编号为10.¹¹⁰¹⁄₂₀₂₅.02.19.639056。

学术背景

研究领域：本研究属于纳米孔测序技术（nanopore sequencing）领域，聚焦于解决高通量核酸测序中信号噪声比（signal-to-noise ratio）的核心挑战。

研究动机：尽管纳米孔测序技术因其单分子检测潜力被开发数十年，但直接测序DNA时，因核苷酸的空间分辨率和分子区分度不足，导致原始读取错误率较高（如Oxford Nanopore技术平均错误率>3%）。此外，现有技术的通量和成本仍无法满足临床诊断和群体基因组学（如UK Biobank、Human Cell Atlas）的需求。

研究目标：开发一种名为“扩增测序（Sequencing by Expansion, SBX）”的新技术，通过将DNA模板转化为可扩展的Xpandomer（XP）聚合物，利用其高信号噪声比的报告代码（reporter codes）实现高精度纳米孔测序。

研究流程与方法

1. SBX技术设计原理

SBX分为合成（synthesis）和测序（sequencing）两个独立流程：
- 合成阶段：将DNA模板通过固相法转化为XP。关键步骤包括：
- 模板杂交：DNA与酸稳定的延伸寡核苷酸（extension oligo, EO）结合，EO通过点击化学固定在微流控芯片表面。
- XP合成：使用改造的DNA聚合酶（XP synthase）以四种可扩展核苷酸三磷酸（XNTPS）为底物，在聚合酶增强剂（PEMs）辅助下延伸。
- 酸处理：裂解XNTPS的磷酰胺键（P–N bond），使XP主链扩展至原DNA长度的50倍以上。
- 光切割释放：XP从固相支持物上释放，准备测序。
- 测序阶段：XP通过α-溶血素（α-hemolysin, AHL）纳米孔，在电场驱动下逐步穿膜。每个报告代码（对应A/T/C/G）通过离子电流信号区分，由转运控制元件（translocation control element, TCE）精确控制步进。

2. 关键创新技术

• XNTPS：通过对称合成的报告链（SSRT）与修饰的dNTP点击环化，含TCE和增强子（enhancer）区域，确保高信噪比和模板依赖性延伸。
  
• XP synthase：基于Dpo4聚合酶改造，含36个突变位点，可处理长链XP合成（>400 bases）。
  
• PEMs：双炔核心的小分子，稳定DNA-XP异源双链，提升聚合酶持续合成能力。
  
• 固相合成流程：优化反应条件（如Mn²⁺浓度、PEG 8000分子拥挤），提高合成效率和准确性。
  

3. 实验验证

• 模板选择：222碱基的链球菌DNA，含发卡结构、同聚物和重复序列，用于测试复杂区域测序能力。
  
• 测序性能：在单纳米孔系统中，XP以1 kHz频率步进，平均通量280 bases/s，读取准确率98.3%（插入/缺失/替换错误率分别为0.56%、0.36%、0.76%）。
  

4. 数据分析

• 信号处理：通过MATLAB脚本解析离子电流轨迹，使用Smith-Waterman算法比对读取序列。
  
• 错误分析：替换错误主要源于XP synthase的碱基选择偏差，插入缺失与TCE设计相关。
  

主要结果

1. XP合成效率：酸处理后的XP长度扩展至原模板的50倍以上，电泳验证显示清晰条带（图1b-c）。
   
2. 纳米孔信号分辨率：四种报告代码的离子电流峰值分离明显（图1g），信号噪声比显著优于直接DNA测序。
   
3. 测序准确性：全长度读取占比26%，中位读取长度181碱基，同聚物和发卡结构区域无显著信号衰减（图9d）。
   
4. 通量潜力：单孔通量达280 bases/s，理论推算8百万孔阵列可实现>5亿bases/s的超高通量。
   

结论与意义

科学价值：
- 首次通过生化转化将DNA序列编码为可扩展聚合物，解决了纳米孔测序的信噪比瓶颈。
- XP synthase和PEMs的设计为高难度合成生物学（如非天然聚合物）提供了新工具。

应用价值：
- 为低成本、高精度的大规模基因组测序（如肿瘤突变检测、单细胞RNA测序）奠定基础。
- 实时数据处理能力支持临床快速诊断。

研究亮点

1. 技术创新：
   
   • XP的模块化设计（XNTPS、TCE、enhancer）实现了化学合成与测序的解耦优化。
     
   • XP synthase的突变库筛选策略可推广至其他聚合酶改造。
     
2. 性能突破：
   
   • 单分子测序准确率（98.3%）超越Oxford Nanopore的原始读取精度。
     
   • 通过CMOS阵列规模化潜力显著。
     

其他有价值内容

• 局限性：当前XP合成耗时较长（1小时），且酸处理可能损伤模板。
  
• 未来方向：优化PEMs化学结构以提升合成速度，开发更稳定的纳米孔阵列接口。
  

（报告全文约2200字，涵盖研究全貌及技术细节）