本研究由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科Yuxiang Hu, Hongtao Tian、武汉市普爱医院骨科Wei Chen、武汉市第一医院骨科Yunlu Liu、河南省人民医院骨科Yulin Cao, Hongxin Pei, Chaochang Ming, Zhipeng Dai、河北医科大学第三医院骨科Wei Chen、华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院骨科Yong Liu、以及来自上海市第八人民医院/江苏大学和上海交通大学附属第六人民医院徐汇分院的Cunqing Shan, Xihui Chen, Shenghui Lan等团队合作完成。通讯作者为Shenghui Lan, Yong Liu, Wei Tong。该研究发表于Advanced Science期刊，于2023年9月27日在线发表（Adv. Sci. 2023, 10, 2303375）。
该研究属于骨科学、生物力学与干细胞生物学交叉领域。废用性骨质疏松是长期制动或处于微重力环境下骨骼因缺乏正常力学刺激而导致的骨量减少、骨脆性增加的临床难题，其具体分子机制尚不完全清楚，也缺乏有效的药物治疗靶点。骨骼的稳态维持高度依赖于机械负荷，而骨髓间充质干细胞（BMSCs）是成骨细胞的主要来源，对机械刺激非常敏感。近年来发现的机械敏感离子通道Piezo1在多种细胞机械力感知中扮演关键角色，已有研究表明其在骨细胞和成骨细胞中调控骨代谢，但Piezo1在BMSCs中、特别是在异常力学环境（如微重力）下的具体作用及其下游机制仍不明确。因此，本研究的主要目的是：探究模拟微重力环境下，Piezo1在BMSCs中的表达与功能变化；阐明激活Piezo1能否挽救微重力诱导的骨丢失；并深入揭示其背后的分子机制。
研究首先利用后肢悬吊小鼠模型模拟体内微重力效应。通过单细胞RNA测序对悬吊组与地面对照组小鼠的骨髓细胞进行无偏性分析。结果显示，悬吊四周后，骨髓中间充质干细胞的比例从对照组的9.6%显著下降到4.1%。同时，Piezo1的表达在对照组的BMSCs中高度富集，而在悬吊后则显著下调。相反，Piezo2的表达在两组间无显著差异。这些结果通过免疫组化、RT-PCR和蛋白质印迹在mRNA和蛋白水平上得到了验证。这一发现将微重力导致的骨丢失与BMSCs数量减少及其Piezo1通道表达下调直接关联起来。
基于此相关性，研究者使用了Piezo1特异性小分子激动剂Yoda1进行干预。通过微型计算机断层扫描分析，发现悬吊两周和四周后，小鼠股骨远端骨小梁体积分数、骨小梁数量、厚度均显著降低，而骨小梁分离度增加，表明骨丢失发生。而Yoda1系统性给药不仅能在正常小鼠中轻微增加骨量，更重要的是，能显著逆转悬吊小鼠的骨丢失。具体数据表明，悬吊四周后，Yoda1治疗组的骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度分别比悬吊对照组增加了110%、98%和44%，骨小梁分离度降低了27%，几乎恢复到地面对照组水平。组织学H&E染色和骨面积定量分析进一步证实了这一结果。血清学ELISA检测和骨切片免疫荧光显示，悬吊导致骨形成标志物骨钙素（Osteocalcin, OC）水平显著下降，成骨细胞数量减少，而Yoda1处理显著提升了血清OC水平和骨组织中骨钙素阳性细胞的数量。破骨细胞活性虽在悬吊后略有增强，但Yoda1对其抑制效应相对较弱。这些结果证明，Piezo1的激活主要通过促进骨形成来挽救模拟微重力下的骨丢失。
为了探究成骨细胞的前体细胞——BMSCs是否介导了Yoda1的骨保护作用，研究者构建了Gli1-CreER; Rosa-tdTomato小鼠进行谱系追踪。Gli1是骨内一类重要的具有干细胞特性的BMSCs的标记物。体内实验显示，Yoda1处理增加了正常和悬吊小鼠骨髓中Gli1+ BMSCs的数量，并且挽救了悬吊导致的Gli1+细胞中骨钙素阳性表达比例的下降。体外实验进一步证实，从悬吊小鼠骨髓中分选出的Gli1+ BMSCs，其Piezo1表达降低，但经Yoda1处理后表达恢复。更重要的是，Yoda1处理显著增强了Gli1+ BMSCs的克隆形成能力和成骨分化潜能。具体表现为，Yoda1提高了悬吊来源的Gli1+ BMSCs的成纤维细胞集落形成单位数量和碱性磷酸酶、茜素红染色的成骨细胞集落形成单位数量，并上调了成骨关键基因（碱性磷酸酶、Runx2、Osterix）的表达。
接下来，研究深入探索了Piezo1激活下游的分子机制。通过对Yoda1处理与未处理的悬吊小鼠骨髓细胞再次进行单细胞RNA测序分析，发现Yoda1处理后，Gli1+ BMSCs中差异上调的基因显著富集于Wnt信号通路。通路分析及验证实验聚焦于Wnt通路的关键效应分子β-连环蛋白及其靶基因激活转录因子4。蛋白质印迹和免疫荧光染色显示，悬吊降低了Gli1+ BMSCs中β-连环蛋白和ATF4的蛋白水平，而Yoda1处理则显著逆转了这一下调。机制上，Piezo1作为钙离子通道，其激活（Yoda1）可引起Gli1+ BMSCs快速的钙离子内流。当使用钙通道阻断剂钆离子或通过慢病毒敲低Piezo1表达时，Yoda1诱导的钙内流被抑制，同时β-连环蛋白和ATF4的上调也被阻断。这表明Piezo1通过介导钙离子内流来激活β-连环蛋白/ATF4信号轴。
为在体内验证该信号轴的功能，研究者使用了Wnt/β-连环蛋白通路抑制剂IWR-1。Micro-CT和组织学分析表明，IWR-1完全消除了Yoda1对悬吊小鼠骨丢失的保护作用。同时，Yoda1对骨髓中Gli1+细胞成骨分化（共表达骨钙素）的促进作用也被IWR-1所阻断。这证明Piezo1的骨保护作用依赖于Wnt/β-连环蛋白通路。
进一步探究β-连环蛋白的下游效应子，研究发现IWR-1处理也阻断了Yoda1诱导的ATF4表达上调，表明ATF4是β-连环蛋白的下游靶点。在体外，使用小干扰RNA敲低ATF4，或者使用IWR-1抑制β-连环蛋白通路，均能显著削弱Yoda1对Gli1+ BMSCs克隆形成和成骨分化的促进作用。这些实验清晰地勾勒出在模拟微重力环境下，Piezo1 → 钙内流 → β-连环蛋白 → ATF4的级联信号通路，该通路是调控Gli1+ BMSCs增殖与成骨分化的关键。
最后，研究探讨了Piezo1激活在其他类型骨质疏松模型中的潜在应用价值。在卵巢切除（模拟绝经后骨质疏松）和自然衰老小鼠模型中，Yoda1治疗也能轻微地缓解骨丢失，但其效果（分别提升骨量约14%和6%）远不如在悬吊模型中显著（提升骨量约41%）。这表明Piezo1激活对废用性/失重性骨质疏松可能具有更强的靶向治疗潜力。
本研究的结论是：模拟微重力导致骨髓Gli1+间充质干细胞中机械敏感离子通道Piezo1表达和功能受损，进而通过抑制其下游的β-连环蛋白/ATF4信号通路，削弱了干细胞的增殖与成骨分化能力，最终导致骨形成不足和骨丢失。系统性地激活Piezo1能够模拟力学刺激，有效逆转这一过程，从而挽救骨丢失。这揭示了Piezo1/β-连环蛋白/ATF4轴在力学调控骨稳态中的核心作用。
该研究的科学价值与应用价值在于：首先，它从单细胞水平精准定位了Piezo1在微重力骨丢失中的关键细胞靶点——Gli1+ BMSCs。其次，它系统阐明了从机械力缺失到细胞功能异常再到组织表型改变（骨质疏松）的完整分子链条，即Piezo1-钙离子-β-连环蛋白-ATF4信号轴，为理解力学调控骨代谢提供了新的机制见解。最后，研究证明了Piezo1激动剂Yoda1具有治疗骨质疏松的潜力，尤其为废用性骨质疏松（如长期卧床、太空飞行等）提供了全新的、基于力学生物学的潜在治疗策略。
本研究的亮点包括：1）采用单细胞RNA测序这一前沿技术进行无偏性探索，发现了BMSCs及其Piezo1表达变化是微重力骨丢失的早期关键事件。2）结合了Gli1谱系追踪小鼠模型，在体内外精确地研究了特定干细胞亚群的功能变化，使结论更具细胞特异性。3）构建了从体外钙成像、基因敲低、到体内药理学阻断（IWR-1）的完整证据链，严谨地验证了Piezo1/β-连环蛋白/ATF4轴的上下游关系。4）研究不仅聚焦于模拟微重力模型，还拓展至卵巢切除和衰老模型，初步评估了Piezo1靶向治疗的普适性与特异性，指出其对力学缺乏型骨质疏松可能更具优势。
此外，研究过程中还对破骨细胞活性进行了初步观察，为未来深入探究Piezo1是否及如何调节骨吸收、以及成骨-破骨细胞对话留下了空间。这项研究是一项机制深入、证据链条完整、具有重要转化潜力的力学生物学工作，为开发针对力学相关性骨骼疾病的靶向疗法奠定了坚实的理论基础。