本文档发表于《Zhang et al. Stem Cell Research & Therapy》期刊（2024年第15卷第505页），由来自北京医院妇产科、国家老年医学中心、中国医学科学院老年医学研究所的张天悦、张梦桐、张思晨和王少伟（通讯作者）共同撰写。这是一篇关于干细胞源性卵巢类器官构建研究进展的综述文章。该综述系统性地总结并深入探讨了利用诱导多能干细胞构建具有生殖和内分泌功能的卵巢类器官这一前沿领域的最新进展、关键技术、现存挑战及未来方向。
干细胞诱导生成生殖细胞的最新策略与挑战 构建卵巢类器官需要同时获得两类核心细胞：生殖细胞（卵母细胞前体）和卵巢体细胞（如颗粒细胞、膜细胞等）。在生殖细胞诱导方面，研究已经从早期的自发分化发展到高效的定向诱导。对于小鼠模型，研究者已建立起相对成熟的体系。例如，Hayashi等人（2011）首次成功从小鼠胚胎干细胞诱导出原始生殖细胞，并通过与性腺体细胞共培养，重构了小鼠卵巢和睾丸，最终获得了后代，尽管出生率较低。这为人类研究奠定了基础。
人类生殖细胞的体外诱导面临更大挑战，但近年来也取得了显著突破。核心在于模拟体内原始生殖细胞发育的信号通路。Irie等人（2015）建立了一套明确的培养体系，通过预先使用包含CHIR99021、PD0325901等四种抑制剂的培养基维持多能干细胞接近“初始态”，随后在含有BMP2/BMP4、LIF、SCF和EGF的悬浮培养中，成功从人胚胎干细胞和诱导多能干细胞中诱导出人类原始生殖细胞样细胞。这些细胞表现出与体内原始生殖细胞相似的基因表达和表观遗传模式。张天悦等人在综述中指出，目前各种转录因子组合（如GATA2/3、SOX17、TFAP2C）的诱导效率在27%至47%之间，仍有提升空间。
更大的难关在于如何将这些原始生殖细胞样细胞进一步诱导为完成减数分裂的成熟配子。目前的策略主要包括与卵巢体细胞共培养以及使用特定信号分子诱导。例如，有研究将人诱导多能干细胞来源的原始生殖细胞样细胞与来自流产胎儿的卵巢体细胞结合，构建异体重组卵巢并移植到免疫缺陷小鼠体内，成功在体内产生了单倍体人卵母细胞，但转化率极低（3.2%）。另一种思路是寻找直接启动减数分裂的关键因子，如视黄酸、DAZL、BOUL等基因已被证明可以促进减数分裂相关标记物的表达，推动生殖细胞向减数分裂进程发展。然而，综述强调，目前的体外条件尚不足以支持减数分裂完整完成，获取遗传和表观遗传稳定的功能性配子仍是核心目标。
卵巢体细胞从干细胞诱导的进展与局限 卵巢功能的实现离不开体细胞的支撑，因此体外诱导产生卵巢体细胞样细胞是另一项关键技术。相较于生殖细胞，这方面研究相对滞后且更具挑战性，因为卵巢体细胞包含多种功能各异的细胞类型。近年来取得了一些进展。例如，Yoshino等人利用Wnt、BMP、Shh和RA等多种信号因子组合，成功将小鼠多能干细胞诱导分化为类似于胚胎期12.5天的卵巢体细胞样细胞。当这些细胞与小鼠原始生殖细胞样细胞共培养时，能够形成重构的卵巢样复合体，并产生功能性卵母细胞。
对于人类细胞，研究也有突破。Liu等人（2013）通过诱导microRNA-17-3p表达并抑制Vimentin表达，将人诱导多能干细胞转化为对雌激素敏感的上皮样细胞，移植到卵巢早衰小鼠模型后能分泌雌二醇。在颗粒细胞诱导方面，Lan等人通过12天的多步骤方案，使用重组信号蛋白将人胚胎干细胞诱导为功能性卵巢颗粒样细胞。更近的一项研究（Smela等，2023）表明，过表达转录因子NR5A1和RUNX1/RUNX2足以以高达70%的效率产生颗粒样细胞，并测试了其内分泌功能。然而，综述指出，目前尚无从多能干细胞成功诱导出膜细胞的报道，且人类卵巢体细胞的诱导研究主要集中在转录组学层面，关键转录因子如FOXL2、GATA4/6、NR5A1等的具体作用和调控机制仍需深入探究。同时，诱导多种卵巢体细胞类型并实现其协调互作，仍是尚未解决的难题。
细胞外基质构建：从天然水凝胶到生物工程支架 类器官的三维生长需要一个模拟体内微环境的细胞外基质作为支撑。Matrigel是目前最常用的基质，但其存在批次差异大、成分不明确、源自小鼠肿瘤等局限性，限制了临床转化前景。因此，开发更优的ECM替代品是当前研究热点。
综述重点讨论了两大方向：合成生物材料和脱细胞ECM。合成生物材料，如海藻酸盐、透明质酸、胶原蛋白及其混合物，具有成分明确、可调控机械性能、成本较低等优点。这些材料已被用于建立支持卵泡发育的三维培养系统，能增强卵泡完整性、直径和卵母细胞成熟。为了进一步提高卵泡存活率，有研究提出在支架中加入血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等促血管生成因子，以吸引内皮细胞，促进血管化。
脱细胞ECM是另一个极具前景的方向。它通过去除卵巢组织的细胞成分（主要是DNA），保留组织的生化成分和结构特征，具有低免疫原性和非肿瘤来源的优点，是构建类器官的理想支架。综述通过表格详细总结了多种用于卵巢组织脱细胞化的方法（如使用SDS、Triton X-100等试剂）及其在不同物种（牛、猪、人等）中的应用效果。研究表明，来自猪或牛卵巢的脱细胞ECM与海藻酸盐等水凝胶结合，能为卵泡生长和卵母细胞成熟提供理想的物理和化学支持，展现出良好的生物相容性。然而，由于伦理限制，获取人源卵巢脱细胞ECM困难，异种来源ECM的临床应用仍需克服免疫排斥等问题。
三维生物打印技术为ECM构建带来了革命性创新。例如，Laronda等人（2017）使用明胶3D打印微孔支架制造了假体卵巢，移植到绝育小鼠体内后部分恢复了卵巢功能（激素分泌和卵泡产生），并最终诞生了健康后代。这些进展表明，将3D打印与脱细胞ECM技术相结合，有望为构建结构精密的卵巢类器官提供强大工具。
卵巢类器官的现状、应用与未来展望 目前，卵巢类器官研究正处于快速发展阶段，其潜在应用广泛，包括：作为疾病模型研究卵巢早衰、多囊卵巢综合征等疾病的机制；用于药物筛选和毒性测试（如已有研究用其筛选盐霉素的细胞毒性）；替代卵巢内分泌功能；以及最终目标——在体外产生成熟卵母细胞用于治疗不孕症和保存生育力。2023年，哈佛大学的研究者将人诱导多能干细胞来源的卵巢体细胞与人类原始生殖细胞样细胞聚集培养，首次报道了完全由人细胞构成的卵巢类器官，这标志着该领域的一个重要里程碑。
然而，构建具有完全生殖和内分泌功能的临床级卵巢类器官仍面临多重挑战。综述在结论部分系统性地指出了这些挑战与未来方向： 1. 细胞诱导方面：需进一步研究人类配子和体细胞发育的生物学与表观遗传学机制，以鉴定驱动多种卵巢细胞类型协同分化的关键因子。当前尚无法诱导出膜细胞，且在无卵巢体细胞支持的情况下完成减数分裂仍未实现。刺激体外类器官模拟体内卵巢的脉冲式激素分泌模式也是一大难点。 2. ECM构建方面：亟需开发具有适宜机械和生物学特性、成分明确、稳定且可大规模生产的ECM，以替代Matrigel。优化合成材料的性能，或结合脱细胞ECM与3D打印技术，是重要方向。 3. 安全性、营养与伦理：必须解决干细胞来源配子的基因组和表观基因组不稳定性可能带来的健康风险。在移植前后，如何为类器官结构提供充足的营养和氧气供应是实际应用的关键瓶颈。此外，该技术引发的伦理和社会问题（如亲缘关系界定、配子潜在滥用等）也需在社会共识基础上建立严格的规范和准则。
综述的价值与意义 本文的价值在于它不仅仅是对现有文献的罗列，而是进行了系统性的梳理、比较与前瞻性分析。首先，它将构建卵巢类器官的两大核心支柱——“干细胞诱导分化”与“细胞外基质工程”——清晰地并列阐述，使读者能全面把握该领域的整体框架与技术脉络。其次，在每一个部分，综述都不仅总结了成功案例，更重点剖析了当前技术的效率瓶颈、失败原因和尚未克服的障碍（如减数分裂完成率低、体细胞类型不全、ECM的临床转化限制等），这种批判性视角对指导未来研究至关重要。再者，综述整合了从小鼠到猪再到人的跨物种研究数据，指出了物种间发育机制的异同，为选择合适的研究模型提供了依据。最后，文章明确指出了未来研究需要聚焦于高通量分析、3D打印支架、高效诱导方案以及自动化、器官芯片平台等方向的整合，描绘了该领域向个性化生殖与再生医学发展的清晰路线图。
这篇综述是一份关于干细胞源性卵巢类器官构建领域的权威性、系统性总结。它为生殖医学、再生医学和组织工程学领域的研究者提供了全面的知识更新、深入的技术洞见和明确的研究方向指引，对于推动该领域从基础研究向临床转化具有重要的参考价值。