作者为Jorge A. Soto、Fabián E. Díaz、Angello Retamal-Díaz、Nicolás M. S. Gálvez、Felipe Melo-González、Alejandro Piña-Iturbe、Mario A. Ramírez、Karen Bohmwald、Pablo A. González、Susan M. Bueno以及Alexis M. Kalergis，研究单位主要为智利天主教大学（Pontificia Universidad Católica de Chile）千年免疫学与免疫治疗研究所及安德烈斯·贝略大学（Universidad Andrés Bello）。该研究于2022年5月4日发表在期刊《Vaccines》上，论文标题为《BCG-Based Vaccines Elicit Antigen-Specific Adaptive and Trained Immunity against SARS-CoV-2 and Andes Orthohantavirus》。
本研究属于疫苗学与免疫学领域，旨在利用卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）作为活载体，构建表达SARS-CoV-2核蛋白（Nucleoprotein, N）与安第斯正汉坦病毒（Andes orthohantavirus，ANDV）核蛋白的重组卡介苗（recombinant BCG, rBCG），并在小鼠模型中评价其安全性与免疫原性。BCG是一种减毒活疫苗，已在全球广泛用于预防结核病超过百年。其不仅能够诱导针对结核分枝杆菌的Th1型免疫应答，还因其可诱导“训练免疫”（trained immunity）而对无关病原体产生非特异性保护，因此被视为开发新型重组疫苗的理想平台。SARS-CoV-2是引起COVID-19大流行的病原体，其核蛋白具有高度保守性和免疫原性。安第斯正汉坦病毒则在美洲引起汉坦病毒心肺综合征（HCPS），病死率可高达20%至40%。由于目前针对这两种病毒的疫苗策略仍有不足，该研究尝试以BCG为载体表达两种病毒的核蛋白，以探索其作为候选疫苗的可行性。
本研究的实验流程主要包括以下几个环节。第一，构建重组BCG菌株。研究团队将SARS-CoV-2核蛋白基因（N-SARS-CoV-2）通过限制性内切酶克隆入整合型质粒pMV361，并利用Gibson组装技术将ANDV核蛋白基因（N-ANDV）克隆入同一载体，随后通过电穿孔转化野生型BCG丹麦1331株（BCG-WT），获得rBCG-N-SARS-CoV-2和rBCG-N-ANDV菌株。第二，重组菌株的扩增与鉴定。菌株在Middlebrook 7H9液体培养基中培养至光密度（OD 600 nm）0.8至1，并通过PCR和Sanger测序确认外源基因的存在。第三，蛋白表达验证。通过Western blot检测重组BCG中N-SARS-CoV-2和N-ANDV蛋白的表达情况，使用针对相应核蛋白的单克隆抗体进行检测。第四，小鼠免疫与安全性评价。对于rBCG-N-SARS-CoV-2，小鼠接受单次皮下注射1×10⁵ CFU的疫苗，对照组为BCG-WT或PBS；对于rBCG-N-ANDV，小鼠接受两次皮下注射，每次1×10⁸ CFU，间隔两周。实验期间每日监测体重和临床评分，评价局部和全身不良反应。第五，细胞免疫应答检测。在免疫后24天或28天，取小鼠脾脏和淋巴结，分离T细胞或脾细胞，与骨髓来源树突状细胞（BMDCs）共培养或直接进行体外抗原再刺激。刺激物包括纯化的重组N-SARS-CoV-2蛋白、N-ANDV蛋白、纯化蛋白衍生物（PPD）以及不相干抗原如人呼吸道合胞病毒（hRSV）核蛋白。通过流式细胞术检测CD4+和CD8+ T细胞表面活化标志CD69、CD71和CD25的表达，通过ELISA检测培养上清中IL-2、IL-4、IFN-γ、IL-6和TNF-α等细胞因子的分泌水平。第六，体液免疫应答检测。采用ELISA检测免疫小鼠血清中针对N-SARS-CoV-2或N-ANDV的特异性IgG抗体水平。第七，训练免疫相关指标评价。在小鼠中，对单独使用rBCG-N-SARS-CoV-2或联合使用表达N蛋白和S蛋白的两种重组BCG的免疫方案进行了评价，检测T细胞在无关抗原刺激下的活化及促炎细胞因子分泌情况，以评估训练免疫效应。
研究结果显示，rBCG-N-SARS-CoV-2和rBCG-N-ANDV均能在体外稳定表达相应的病毒核蛋白，其中rBCG-N-ANDV筛选出两个阳性克隆，克隆2因蛋白表达水平更高而被用于后续实验。安全性评价方面，两种重组BCG疫苗在小鼠中均未引起明显体重下降或临床不良反应，免疫组与未免疫组在行为和生理指标上无显著差异，提示疫苗具有良好的耐受性。在细胞免疫方面，rBCG-N-SARS-CoV-2免疫小鼠的CD4+ T细胞在体外经N-SARS-CoV-2蛋白刺激后，CD69和CD25表达显著上升，其中CD25阳性细胞比例可达20%至30%；CD8+ T细胞中CD69、CD71和CD25的表达均显著高于未刺激或PPD刺激的细胞。rBCG-N-ANDV免疫组也观察到抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞活化，CD69、CD71和CD25表达升高。值得注意的是，BCG-WT免疫组在N-ANDV抗原刺激下也出现了CD4+ T细胞CD69表达增加，提示BCG本身具有非特异性免疫增强作用。在细胞因子分泌方面，rBCG-N-SARS-CoV-2免疫小鼠的T细胞在N抗原或PPD刺激后IFN-γ分泌显著增加；rBCG-N-ANDV免疫组中IL-2和IFN-γ分泌在N抗原或PPD刺激下显著上升，而IL-4水平各组均较低，表明免疫应答偏向Th1型。训练免疫评价实验中，用混合重组BCG免疫的小鼠，其CD4+ T细胞在hRSV核蛋白刺激后CD69、CD71和CD25表达增高，且IL-2和IFN-γ分泌增加；BCG-WT免疫组也表现类似趋势。此外，rBCG-N-SARS-CoV-2免疫组的IL-6分泌在N抗原或PPD刺激下升高，但未观察到TNF-α的显著变化。在体液免疫方面，rBCG-N-SARS-CoV-2和rBCG-N-ANDV免疫小鼠血清中检测到针对相应核蛋白的特异性IgG，但总体水平较低，吸光度值接近0.6。虽然抗体应答较为温和，但在免疫组与未免疫组之间仍具有统计学显著差异。
综合来看，本研究证实了以BCG为载体表达SARS-CoV-2和ANDV核蛋白的可行性，重组BCG疫苗在小鼠中安全且具有免疫原性。两种疫苗均能诱导抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞活化，并促进IFN-γ和IL-2等Th1型细胞因子的分泌，提示其具备良好的细胞免疫应答。同时，BCG免疫还增强了T细胞对无关抗原的反应性，表明其可诱导训练免疫。然而，重组BCG诱导的特异性抗体水平较低，提示该疫苗策略在体液免疫方面仍需进一步优化，未来可能需要通过加强免疫或病毒挑战来验证其保护效力。该研究为开发针对SARS-CoV-2和安第斯正汉坦病毒的BCG载体疫苗提供了重要的前期实验依据。其科学价值在于拓展了BCG作为重组疫苗载体的应用范围，并为呼吸道病毒疫苗研发提供了新思路；应用价值在于rBCG-N-SARS-CoV-2和rBCG-N-ANDV有望成为成本较低、易于储存和运输的候选疫苗，尤其适用于资源有限的地区。研究的亮点包括：首次报道了以BCG为载体同时探索针对SARS-CoV-2和ANDV核蛋白的疫苗策略；验证了单一低剂量rBCG-N-SARS-CoV-2即可诱导较强的细胞免疫应答；并初步揭示了重组BCG疫苗诱导训练免疫的表型特征。