皮肤微生物群在调节表皮分化和免疫反应中发挥关键作用，但不同微生物物种如何影响皮肤屏障蛋白表达和脂质合成通路，仍需进一步阐明。本研究由Haivin Kim和Aram Kim（共同第一作者）及通讯作者Jung U Shin等人完成，研究单位包括韩国CHA大学医学生命科学系、AEKYUNG株式会社中央研究所、CHA大学医学院CHA盆唐医疗中心皮肤科以及StratumBio公司。该研究发表于《Annals of Dermatology》2025年10月第37卷第5期，文献标识为276-285页，出版日期为2025年7月28日。

本研究的学术背景是皮肤屏障结构和功能维持依赖于角质细胞分化形成的角质包膜蛋白（包括filaggrin [FLG]、loricrin [LOR]和involucrin [IVL]）以及细胞间脂质基质（主要由神经酰胺、胆固醇和游离脂肪酸构成）。皮肤表面栖息着多种共生或机会性微生物，包括Staphylococcus aureus（金黄色葡萄球菌）、Staphylococcus hominis（人葡萄球菌）和Cutibacterium acnes（痤疮丙酸杆菌）。已有研究表明，菌群失调与特应性皮炎、痤疮和银屑病等炎症性皮肤病密切相关，但不同菌种对皮肤屏障蛋白和脂质合成酶的具体调节作用尚不完全清楚。传统2D角质形成细胞培养缺少完全分化的角质层，而动物模型的皮肤微生物组成与人类差异较大，因此本研究同时使用2D单层角质形成细胞和体外3D皮肤模型，以克服上述局限，系统比较这三种菌对屏障蛋白表达和脂质合成的差异性影响。

研究的详细工作流程包括细菌培养、2D角质形成细胞培养与分化诱导、体外3D皮肤模型构建、细菌处理、定量PCR、免疫荧光染色和油红O染色等多个环节。在细菌培养方面，C. acnes在厌氧条件下37°C培养72小时，S. aureus和S. hominis则在37°C培养24小时，菌液浓度通过OD600测定。2D角质形成细胞使用添加角质形成细胞生长因子的培养基培养，并加入终浓度为1.5 mM的Ca²⁺处理5天以诱导终末分化，最后18小时加入细菌。体外3D皮肤模型购自StratumBio公司，构建流程为：将人真皮成纤维细胞接种到纸环支架上并在6孔板中培养4周以形成真皮层；随后在真皮构建物上接种角质形成细胞，在浸没条件下共培养1周；再于气液界面继续培养2周以促进表皮分层和分化。细菌应用时，将各菌液调整至1×10⁸ CFU，取10 µl（即1×10⁶ CFU）滴加于3D皮肤模型表皮表面，处理时间为气液界面阶段最后18小时。定量PCR使用TRIzol提取总RNA，M-MLV逆转录酶合成cDNA，SYBR Green进行实时定量PCR，以GAPDH作为内参，以2⁻⁽ΔΔCt⁾法计算相对表达量。免疫荧光染色使用4%多聚甲醛固定、0.1% Tween-20透化、封闭后，分别以FLG、IVL和LOR一抗4°C孵育过夜，再用Alexa Fluor 488标记二抗，DAPI染核后荧光显微镜拍摄。油红O染色则用于检测角质形成细胞中脂质积累情况，染色后以苏木素复染并拍照。统计分析采用GraphPad Prism 10.0，两组比较采用t检验，P<0.05认为差异显著。

研究结果首先展示了S. aureus对皮肤屏障蛋白表达的影响。在2D角质形成细胞中，S. aureus显著下调FLG、LOR和IVL的mRNA表达；而在体外3D皮肤模型中，S. aureus却上调这三种蛋白的mRNA表达，免疫荧光染色也显示FLG和LOR蛋白在S. aureus处理的3D模型中增强。这种2D与3D系统之间的差异可能归因于3D模型存在完整分化的角质层，能更好地模拟表皮结构。其次，S. hominis在2D角质形成细胞中显著上调FLG和LOR的mRNA表达，IVL无显著变化；在3D模型中显著上调LOR和IVL，FLG有上升趋势但未达到统计学意义，免疫荧光染色证实FLG、LOR和IVL蛋白表达增强。此外，3D模型共处理S. aureus和S. hominis时，LOR和IVL仍显著上调，表明S. hominis可能具有抑制S. aureus破坏屏障的潜力。第三，C. acnes在2D角质形成细胞中显著上调FLG和LOR，IVL无变化；在3D模型中仅IVL显著上调，FLG和LOR无显著改变，免疫荧光染色也显示IVL表达增强。在脂质合成方面，油红O染色显示S. aureus处理的角质形成细胞脂质积累减少；qPCR显示在2D培养中S. aureus显著下调ELOVL1、ELOVL4和ELOVL6 mRNA，ELOVL3反而上调，FASN有下降趋势但不显著；在3D模型中S. aureus一致抑制ELOVL1、ELOVL3、ELOVL4和FASN，ELOVL6也有下降但不显著。S. hominis处理则增加油红O染色脂质积累；2D培养中显著上调ELOVL1和FASN，ELOVL3有升高趋势但不显著；3D模型中ELOVL3和FASN显著上调，ELOVL1和ELOVL4有上升趋势。3D模型共处理S. aureus和S. hominis时，ELOVL1、ELOVL4、ELOVL6和FASN mRNA表达均增加，提示S. hominis增强脂质生物合成，可能拮抗S. aureus介导的屏障破坏。C. acnes处理显著增加脂滴数量和大小；2D培养中C. acnes显著上调ELOVL1、ELOVL3、ELOVL4、ELOVL6和FASN；3D模型中ELOVL6和FASN显著上调，ELOVL4显著下调，ELOVL1不显著下降，ELOVL3无变化。这些结果表明不同微生物对皮肤屏障蛋白和脂质合成通路具有差异性调节效应，且2D和3D模型可能因细菌接触方式、分化状态和角质层屏障的差异而呈现不同的反应模式。

结论部分指出，S. aureus通过下调屏障相关蛋白和脂质合成酶的表达而损害皮肤屏障功能；S. hominis和C. acnes则通过上调这些成分增强屏障完整性。这些差异性微生物效应阐明了皮肤微生物组参与屏障稳态调节的潜在机制。本研究的科学价值在于，在体外2D和3D模型中系统比较了三种代表性皮肤微生物对屏障蛋白和脂质合成的调节作用，揭示了S. hominis和C. acnes可能具有支持皮肤屏障功能的益生特性，且S. hominis可能拮抗S. aureus引起的屏障损伤。研究应用价值体现在为未来开发基于皮肤共生菌的局部微生态干预或皮肤屏障修复策略提供了实验依据。研究亮点包括同时使用2D和3D模型揭示微生物效应的模型依赖性差异、2D和3D模型之间细菌应用方式不同（2D中直接加入培养基、3D中局部滴加至表皮表面）以及首次在体外3D皮肤模型中共处理S. aureus和S. hominis以探讨两种菌的交互作用。研究也存在局限性，如缺乏免疫细胞、仅纳入三种代表性菌种、以及脂质代谢检测仅限于ELOVL家族和FASN等，未来可结合共培养免疫细胞、扩增菌种谱和检测更多脂质代谢标志物加以完善。