学术研究报告：ADMSC来源的外泌体通过递送miR-92a-1-5p抑制中性粒细胞胞外诱捕网形成促进糖尿病伤口愈合

一、 研究作者、机构与发表信息

本研究由 Wei Li, Hong Zhang, Pengxing Bai, Hui Wang, Feng Hou, Zheqi Zhou 和 Wenbo Li* 共同完成。主要完成单位均位于中国陕西省西安市，包括陕西省人民医院的血管外科（Wei Li, Hong Zhang, Hui Wang, Feng Hou）、胸外科（Pengxing Bai）、普外一科（Zheqi Zhou）和心血管三科（Wenbo Li）。通讯作者为 Wenbo Li。该研究论文于2026年1月30日被接受，并于2026年1月31日在线发表于学术期刊 Archives of Biochemistry and Biophysics，卷号 778，文章编号 110755。

二、 学术背景与研究目的

本研究属于再生医学、糖尿病并发症与细胞外囊泡（Extracellular Vesicles）研究的交叉领域。糖尿病创面（如糖尿病足溃疡）愈合障碍是糖尿病最常见的严重并发症之一，发病率高，可导致剧烈疼痛、残疾，甚至截肢和死亡风险。传统治疗方法效果有限，迫切需要新的治疗策略。伤口愈合延迟涉及复杂的病理因素，包括慢性炎症和中性粒细胞功能障碍。近年来的研究证据表明，中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps， NETs）的形成与糖尿病伤口愈合障碍密切相关。NETs是由中性粒细胞释放的去凝聚染色质、髓过氧化物酶（Myeloperoxidase， MPO）、中性粒细胞弹性蛋白酶等组成的网状丝状结构，过量的NETs会引发过度炎症、组织损伤并损害伤口愈合。

另一方面，脂肪来源的间充质干细胞（Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells， ADMSCs）及其衍生的外泌体（ADMSC-derived exosomes， ADMSC-ex）因具有强大的抗炎和再生特性，在促进组织修复和伤口愈合方面显示出巨大潜力，且来源丰富、易于获取，是生产治疗性外泌体的理想候选者。已有研究表明，干细胞来源的外泌体具有抑制NETs形成的能力。

然而，ADMSC-ex在糖尿病伤口愈合中发挥治疗作用的具体分子机制，特别是其是否以及如何通过影响NETs形成来促进愈合，在很大程度上仍不清楚。同时，S100钙结合蛋白A9（S100 Calcium-binding Protein A9， S100A9）是中性粒细胞中最丰富的细胞内蛋白之一，在NETs形成过程中大量释放，并能诱导中性粒细胞活化。抑制S100A9已被证明可以抑制多种疾病中的NETs形成。生物信息学分析也显示，S100A9在糖尿病足部组织中显著上调，并与伤口愈合延迟相关。

因此，本研究旨在深入探究ADMSC-ex促进糖尿病伤口愈合的分子机制，特别是聚焦于ADMSC-ex是否通过递送特定的生物活性分子（如microRNA）来靶向S100A9，进而抑制高糖诱导的NETs形成，最终加速伤口愈合。其目标是为理解ADMSC-ex的治疗效应提供新的理论依据，并为开发改善糖尿病伤口愈合的新治疗策略奠定基础。

三、 详细研究流程

本研究是一项综合性的基础与临床前研究，结合了体外细胞实验和体内动物模型，遵循了从现象观察到机制探索，再到体内验证的逻辑链条。具体流程如下：

1. ADMSCs与外泌体的制备与鉴定：

   • 研究对象与样本：研究使用从健康成年人吸脂手术废弃的皮下脂肪组织中无菌分离出的ADMSCs。
   • 处理方法：通过I型胶原酶消化、离心、过滤、培养传代获得第三代ADMSCs。通过流式细胞术鉴定细胞表面标志物（CD44、CD105阳性，CD19、CD45阴性）。
   • 外泌体分离：将ADMSCs在无血清培养基中培养24小时后，收集上清液，采用超速离心法（100，000 g， 70分钟，两次）分离纯化ADMSC-ex。
   • 外泌体鉴定：使用透射电子显微镜观察外泌体形态（典型的囊泡状，表面光滑）；使用纳米流式细胞仪分析粒径分布（平均直径74.9 ± 14.2 nm，主要分布在50-150 nm）；通过蛋白质印迹法检测外泌体标志蛋白CD9、CD63和CD81的表达。
   • 工程化外泌体制备：为研究特定miRNA的功能，使用脂质体转染法，将miR-92a-1-5p模拟物（mimics）或抑制剂（inhibitors）转染入ADMSCs，然后从这些过表达或敲低miR-92a-1-5p的ADMSCs中分别分离出相应的工程化外泌体。

2. 糖尿病大鼠伤口愈合模型的建立与体内治疗：

   • 研究对象与样本：使用8周龄雄性Sprague-Dawley大鼠，体重180-220克。将大鼠随机分为5组：正常对照组、糖尿病组、糖尿病+ADMSC-ex治疗组、糖尿病+miR-92a-1-5p过表达ADMSC-ex治疗组、糖尿病+miR-92a-1-5p敲低ADMSC-ex治疗组，每组12只。
   • 模型建立：通过高脂饮食联合链脲佐菌素腹腔注射诱导糖尿病大鼠模型。一周后，空腹血糖≥16.7 mmol/L视为建模成功。在建模两周后，于大鼠背部制造直径1 cm的全层圆形皮肤切除伤口，建立糖尿病皮肤伤口愈合模型。
   • 处理方法：术后当天开始，在伤口边缘四个点进行注射治疗。正常对照组和糖尿病组注射磷酸盐缓冲液；其他治疗组分别注射溶解在PBS中的ADMSC-ex、miR-92a-1-5p过表达ADMSC-ex或miR-92a-1-5p敲低ADMSC-ex（剂量为2 mg外泌体/200 μl PBS）。
   • 观察与取样：每天监测并测量伤口面积，计算残余伤口面积百分比。术后第6天，每组处死6只大鼠，收集血清和伤口中心组织用于后续实验。剩余大鼠继续饲养至第18天观察愈合情况。

3. 体内疗效与NETs形成评估：

   • 组织学分析：术后第6天收集的伤口组织进行石蜡包埋切片。进行苏木精-伊红染色评估肉芽组织形成和再上皮化；进行Masson三色染色评估胶原沉积。
   • NETs形成检测：
     • 免疫荧光：使用抗瓜氨酸化组蛋白3和抗MPO抗体对伤口组织切片进行双重免疫荧光染色，通过共定位情况评估NETs形成，并用ImageJ软件量化荧光强度。
     • 蛋白质印迹法：检测伤口组织中NETs形成的关键蛋白标志物，包括瓜氨酸化组蛋白3和肽基精氨酸脱亚胺酶4（Peptidyl Arginine Deiminase 4， PAD4）的表达水平。
     • 酶联免疫吸附测定：检测血清中的MPO水平。

4. 体外机制研究：

   • 研究对象与样本：从健康大鼠外周血中分离和纯化原代中性粒细胞。
   • 实验分组与处理：中性粒细胞分为对照组（正常葡萄糖培养基）、高糖组（30 mmol/L葡萄糖培养基）、高糖+ADMSC-ex组、高糖+miR-92a-1-5p过表达ADMSC-ex组、高糖+miR-92a-1-5p敲低ADMSC-ex组。共培养3小时后进行分析。
   • 外泌体摄取验证：使用PKH67绿色荧光染料标记ADMSC-ex，与中性粒细胞共培养后，通过荧光显微镜观察外泌体是否被中性粒细胞摄取。
   • NETs形成检测：
     • 碘化丙啶染色：直接观察细胞死亡和NETs结构。
     • 免疫荧光：检测中性粒细胞内瓜氨酸化组蛋白3的表达。
     • 蛋白质印迹法：检测中性粒细胞内瓜氨酸化组蛋白3、PAD4以及S100A9的蛋白表达。
     • ELISA：检测细胞培养上清液中MPO和S100A9的分泌水平。

5. 生物信息学分析与靶点验证：

   • 差异基因筛选：从NCBI GEO数据库下载人类糖尿病足溃疡与非糖尿病足部皮肤的转录组测序数据，筛选差异表达基因，发现S100A9在糖尿病伤口中显著上调。
   • miRNA靶点预测：使用TargetScan在线工具预测可能与大鼠S100A9基因3‘-非翻译区结合的microRNA，发现hsa-miR-92a-1-5p和rno-miR-92a-1-5p均可结合。
   • 双荧光素酶报告基因实验：构建含有野生型或突变型大鼠S100A9 3‘-UTR的报告基因载体，与hsa-miR-92a-1-5p模拟物共转染至中性粒细胞，检测荧光素酶活性变化，验证miR-92a-1-5p与S100A9的直接靶向关系。
   • miRNA表达检测：使用定量实时聚合酶链式反应检测ADMSCs和ADMSC-ex中miR-92a-1-5p的表达水平，并验证转染后其表达的变化。

6. 数据统计分析：所有数据以均值±标准差表示。使用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析及Bonferroni校正。P值小于0.05认为具有统计学显著性差异。

四、 主要研究结果

1. ADMSC-ex可加速糖尿病大鼠的皮肤伤口愈合：与正常对照组相比，糖尿病组的伤口愈合显著延迟，术后第18天残余伤口面积更大。ADMSC-ex治疗显著减少了糖尿病大鼠的残余伤口面积。组织学分析显示，糖尿病组伤口组织创伤严重，而ADMSC-ex治疗组出现了更多的再上皮化。Masson染色表明，糖尿病组胶原沉积显著减少，而ADMSC-ex治疗增加了胶原沉积。这些结果证实了ADMSC-ex在体内促进糖尿病伤口愈合的疗效。

2. ADMSC-ex可减少糖尿病伤口模型中的NETs形成：免疫荧光结果显示，糖尿病组伤口组织中瓜氨酸化组蛋白3和MPO的表达（NETs标志物）显著高于正常对照组，而ADMSC-ex治疗降低了它们的表达。血清MPO水平在糖尿病组升高，经ADMSC-ex治疗后下降。蛋白质印迹结果进一步证实，糖尿病伤口组织中瓜氨酸化组蛋白3和PAD4的蛋白表达上调，而ADMSC-ex处理可下调这些蛋白的表达。这些数据表明，糖尿病状态会诱导伤口局部NETs形成，而ADMSC-ex能够有效抑制这一过程。这一发现将ADMSC-ex的促愈合作用与NETs抑制联系起来，为后续机制探索指明了方向。

3. ADMSC-ex在体外抑制高糖诱导的NETs形成：PKH67标记实验证实ADMSC-ex可被中性粒细胞摄取。在高糖刺激下，中性粒细胞内瓜氨酸化组蛋白3和PAD4蛋白表达、上清液中MPO水平均显著升高，表明NETs形成增加。加入ADMSC-ex共培养后，这些指标均被显著抑制。这直接将ADMSC-ex的NETs抑制效应定位到了中性粒细胞层面，并建立了可重复的体外研究模型。

4. S100A9是ADMSC-ex作用的关键下游靶点：生物信息学分析显示，S100A9在人类糖尿病足溃疡组织中显著上调。体内实验证实，糖尿病大鼠伤口组织中S100A9蛋白表达升高，而ADMSC-ex治疗可降低其表达。体外实验同样显示，高糖刺激下中性粒细胞分泌的S100A9增加，ADMSC-ex处理可减少其分泌。这提示S100A9可能是ADMSC-ex调控NETs形成的一个关键环节。

5. ADMSC-ex通过递送miR-92a-1-5p靶向抑制S100A9：qRT-PCR证实ADMSCs及其外泌体中富含miR-92a-1-5p。靶点预测和双荧光素酶报告基因实验证明，hsa-miR-92a-1-5p可直接靶向并结合大鼠S100A9的3‘-UTR。机制上，从过表达miR-92a-1-5p的ADMSCs中获得的外泌体，比普通ADMSC-ex更强地抑制了高糖诱导的中性粒细胞死亡、瓜氨酸化组蛋白3表达、MPO和S100A9分泌，以及PAD4蛋白表达。相反，从敲低miR-92a-1-5p的ADMSCs中获得的外泌体，其抑制NETs形成和降低S100A9的作用被削弱。这些结果清晰地证明，ADMSC-ex是通过将其携带的miR-92a-1-5p递送至中性粒细胞，从而靶向抑制S100A9的表达，最终实现抑制NETs形成。

6. miR-92a-1-5p敲低削弱ADMSC-ex在体内的促愈合作用：体内治疗实验提供了最终验证。与注射普通ADMSC-ex相比，注射miR-92a-1-5p敲低ADMSC-ex的糖尿病大鼠，其伤口愈合速度明显变慢，残余伤口面积更大。同时，该组伤口组织中的瓜氨酸化组蛋白3和MPO表达（NETs标志）以及血清MPO水平均高于普通ADMSC-ex治疗组。而过表达miR-92a-1-5p的外泌体并未表现出比普通外泌体更强的促愈合效果（可能已达到平台效应）。该结果在活体动物水平证实，ADMSC-ex所递送的miR-92a-1-5p是其发挥促糖尿病伤口愈合和抑制NETs形成作用所必需的。

五、 研究结论与价值

本研究得出结论：脂肪来源间充质干细胞外泌体通过递送miR-92a-1-5p，靶向抑制S100A9的表达，从而减少高糖诱导的中性粒细胞胞外诱捕网形成，最终加速糖尿病伤口愈合。这揭示了一条全新的、保守的miR-92a-1-5p/S100A9信号通路在ADMSC-ex治疗糖尿病伤口中的作用机制。

科学价值： 1. 机制创新：首次系统阐明了ADMSC-ex通过“外泌体-miRNA-靶基因-细胞功能（NETs）”轴促进糖尿病伤口愈合的具体分子通路，将外泌体治疗、表观遗传调控（miRNA）、炎症反应（NETs）和特定蛋白（S100A9）有机联系起来，加深了对干细胞外泌体疗法作用机制的理解。 2. 靶点发现：明确了S100A9作为糖尿病伤口NETs形成和愈合障碍中的一个关键调节因子，并且是miR-92a-1-5p的直接靶点，为糖尿病创面治疗提供了新的潜在干预靶点。 3. 跨物种验证：虽然使用的是人源ADMSC-ex和大鼠模型，但通过序列分析和功能实验，验证了人源miR-92a-1-5p与大鼠S100A9靶向作用的保守性，为后续临床转化研究提供了重要的临床前依据。

应用价值： 1. 治疗策略：研究表明，负载miR-92a-1-5p的ADMSC-ex或其模拟物/工程化外泌体，有望成为一种有前景的新型治疗剂，用于管理糖尿病伤口愈合障碍。 2. 诊断潜力：S100A9和NETs相关标志物（如瓜氨酸化组蛋白3、MPO）可能作为评估糖尿病伤口严重程度和治疗效果的生物标志物。

六、 研究亮点

1. 完整的逻辑证据链：研究从表型（伤口愈合）入手，关联到细胞事件（NETs形成），再深入到分子机制（miR-92a-1-5p/S100A9轴），并综合运用生物信息学、分子生物学、细胞实验和动物模型进行了多层次、多角度的验证，逻辑严谨，证据充分。
2. 巧妙的工程化外泌体策略：通过改变亲本ADMSCs中miR-92a-1-5p的表达来获得不同miRNA载量的外泌体，从而在功能获得和功能缺失两个方向上明确证实了该miRNA在外泌体疗效中的核心作用，是研究外泌体内容物功能的标准且有效的方法。
3. 聚焦于新兴的NETs病理机制：将ADMSC-ex的治疗效应与当前糖尿病并发症研究中热门的NETs病理机制直接挂钩，选题具有前沿性和创新性。
4. 明确的转化医学导向：整个研究旨在揭示机制的同时，最终指向了开发基于外泌体或miRNA的新型治疗方法的可能性，体现了基础研究与临床应用的结合。

七、 其他有价值内容

研究团队在讨论部分也客观指出了本研究的局限性：首先，研究主要关注ADMSC-ex对NETs形成的影响，但其他细胞死亡途径如铁死亡、细胞焦亡也可能参与糖尿病伤口愈合过程。其次，ADMSC-ex包含多种组分，可能存在其他尚未阐明的机制共同发挥作用。最后，研究使用人源外泌体治疗大鼠模型，虽然验证了保守的靶向作用，但其确切机制在人类糖尿病伤口愈合中是否完全适用仍需进一步研究。这些思考为未来更深入、更系统的研究指明了方向。