本研究由Rebecca Faresjö、Elisabet O. Sjöström、Tiffany Dallas、Magnus M. Berglund、Jonas Eriksson、Dag Sehlin和Stina Syvänen等人完成，主要作者来自Uppsala University（乌普萨拉大学）公共卫生与护理科学系、Key2Brain AB以及乌普萨拉大学医院PET中心。该研究于2024年10月2日在线发表于《mAbs》期刊，论文标题为“Single domain antibody-scFv conjugate targeting amyloid β and TfR penetrates the blood–brain barrier and interacts with amyloid β”。

本研究的学术背景聚焦于神经退行性疾病，特别是阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的免疫治疗。尽管lecanemab和donanemab等抗体药物已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于AD治疗，但抗体跨越血脑屏障（blood–brain barrier，BBB）的效率极低，通常系统性给药的抗体中不足0.1%能到达脑部，导致需要大剂量给药，既增加成本又可能引发外周副作用。为解决这一问题，研究者利用转铁蛋白受体（transferrin receptor，TfR）介导的转胞吞作用（receptor-mediated transcytosis，RMT）作为脑递送策略。TfR是BBB上研究最广泛且临床验证最充分的受体之一。以往研究表明，将鼠TfR特异性单链可变区片段scFv8D3与治疗性抗体融合能显著提高抗体在小鼠脑内的浓度。本研究重点开发了来源于骆驼科动物的重链抗体可变区片段（single-domain antibody，VHH），这些VHH分子量仅12–15 kDa，具有高靶标特异性、快速血液清除和易于重组表达等优势。研究目标是建立能与人TfR（human TfR，hTfR）和小鼠TfR（mouse TfR，mTfR）交叉反应的VHH结合物，并将其与抗淀粉样β（amyloid β，Aβ）抗体3D6的单链可变区片段（scFv3D6）融合，制备双特异性融合蛋白，用于促进BBB穿透并靶向Aβ病理，从而为AD的治疗和诊断提供新策略。

研究流程主要包括以下几个环节。首先，研究者构建并表达了四种VHH-Fc融合蛋白（FPFc），其中VHH1和VHH4具有人鼠交叉反应性，VHH2仅结合mTfR，VHH3仅结合hTfR。这些VHH与人类IgG Fc结构域的N端融合，形成约75 kDa的IgG样融合蛋白。随后，将上述VHH分别与scFv3D6融合，形成约60 kDa以下的小型双特异性融合蛋白（FPscFv）。融合方向分为两种：VHH融合于scFv3D6的C端（a方向）或N端（b方向），共得到12种融合蛋白用于评价。体外评价采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）技术测定融合蛋白对mTfR和hTfR的结合能力及动力学参数。结果显示，FPFc1和FPFc4对两种TfR均有结合，且对hTfR的结合更强；FPFc2仅结合mTfR，FPFc3仅结合hTfR。SPR数据显示FPFc1对hTfR的解离平衡常数（KD）为0.067 nM，对mTfR为11 nM；FPFc4对hTfR的KD低至0.00053 nM，对mTfR为0.27 nM。单价的FPscFv较二价的FPFc在结合能力上有所下降，但保留了物种选择性。体内研究方面，研究者将融合蛋白用碘-125（125I）放射性标记后经尾静脉注射到野生型小鼠、hTfR基因敲入小鼠以及Aβ病理模型小鼠（AppNL-G-F）中。在注射后不同时间点（2小时、2.5小时、6小时和24小时）处死动物，测定血液、血浆、脑及外周器官的放射性分布。通过脑切片放射自显影、CD31免疫染色和核径迹乳胶（nuclear track emulsion，NTE）微放射自显影技术，分析融合蛋白在脑血管与脑实质中的相对分布。数据分析采用单向或双向方差分析（ANOVA）及Bonferroni事后检验，显著性水平设定为p < 0.05。

研究获得了多项重要结果。体外实验中，FPFc1和FPFc4表现出对人鼠TfR的交叉反应性，其中FPFc4对hTfR的亲和力极高，SPR测定KD值低于可测量范围。与scFv3D6融合后，FPscFv1b和FPscFv4b对hTfR的KD分别为0.84 nM和0.19 nM，对mTfR分别为19 nM和1.8 nM，表明N端融合（b方向）比C端融合（a方向）更好地保留了TfR结合能力。体内实验中，野生型小鼠注射后2.5小时，mTfR特异性的FPFc2脑内浓度为2.9 ± 0.2%ID/g brain，交叉反应性的FPFc1为1.2 ± 0.3%ID/g brain，而仅结合hTfR的FPFc3仅为0.17 ± 0.04%ID/g brain。在hTfR基因敲入小鼠中，FPFc3的脑内浓度显著升高，证明其能通过hTfR介导的BBB转运进入脑内。NTE结果显示FPFc2在脑毛细血管中的滞留最高，而FPFc1在脑实质中的相对分布比例更高。对于FPscFv，2小时时野生型小鼠中N端融合的FPscFv1b和FPscFv4b的脑内浓度分别比对应的a方向融合蛋白高出3倍和2倍。在24小时时间点，除FPscFv1a外，所有FPscFv在AppNL-G-F小鼠中的脑内滞留均显著高于野生型小鼠，其中FPscFv1b在两种基因型间的脑浓度差异最大，达到17倍。6小时时间点，FPscFv1b在AppNL-G-F小鼠中脑浓度比野生型高2.5倍，且NTE显示其与Aβ病理斑块及部分脑血管结合。血液药代动力学方面，FPFc蛋白中高mTfR亲和力与快速血液清除相关，而FPscFv中高mTfR亲和力反而与较慢血液清除相关，这种差异可能源于FC结构域本身延长半衰期的特性与TfR介导清除之间的复杂相互作用。

研究结论指出，TfR结合亲和力对脑递送效率具有关键影响，但并非越高越好。高亲和力虽然能增加脑内总浓度，但也会导致更多的融合蛋白滞留在脑毛细血管中，减少进入脑实质的比例。对于诊断性放射配体而言，低至中等亲和力更有利于降低血液背景和毛细血管滞留，提高靶标特异性信号。本研究证明了新型VHH-TfR结合物与scFv3D6融合后能有效穿越BBB并与Aβ病理相互作用，且存在一个“最佳亲和力窗口”，在此窗口内脑实质递送充分且血液药代动力学符合应用需求。该研究为AD的抗体治疗和PET诊断提供了新的分子工具和设计策略。

本研究的亮点包括：开发了人鼠交叉反应性VHH TfR结合物，解决了以往大多数TfR结合物物种特异性的问题；系统比较了FC融合与scFv融合、以及不同融合方向对BBB穿透和脑内分布的影响；首次将VHH-scFv双特异性融合蛋白用于AD小鼠模型的体内评价，证实其与Aβ病理的结合能力；发现TfR亲和力与脑实质递送之间的非单调关系，为优化双特异性抗体的设计提供了实验依据。此外，研究还揭示了分子大小、FC结构域、TfR亲和力以及靶标亲和力之间复杂的相互作用，对临床转化具有指导意义。