关于小分子通过稳定扭曲的TNF三聚体破坏TNF-TNFR1信号传导的结构性见解学术研究报告
第一， 研究的主要作者、机构、发表期刊及时间
本研究由David McMillan、Carlos Martinez-Fleites、John Porter、David Fox 3rd、Rachel Davis、Prashant Mori、Tom Ceska、Bruce Carrington、Alastair Lawson、Tim Bourne及James O’Connell共同完成。作者主要来自英国的UCB Pharma公司（Slough, SL1 3WE, UK），部分作者也来自GlaxoSmithKline公司（Stevenage, SG1 2NY, UK）和美国UCB Pharma（Bainbridge Island, WA 98110, USA）。通讯作者为David McMillan。该研究发表于 Nature Communications 期刊，于2021年发表，文章具体信息为：Nature Communications | (2021) 12:582 | https://doi.org/10.1038/s41467-020-20828-3。
第二， 研究的学术背景
本研究属于结构生物学、免疫学和药物发现交叉领域，聚焦于肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor, TNF）的信号传导机制及其小分子抑制。TNF是一种关键的前炎症细胞因子，在类风湿性关节炎、克罗恩病等多种自身免疫性疾病中扮演核心角色。目前临床上已有多种TNF生物制剂（如抗体类药物），它们通过完全阻断TNF与其受体（TNFR1和TNFR2）的结合来发挥疗效。然而，针对TNF-TNFR这一高亲和力蛋白-蛋白相互作用界面，开发有效的小分子抑制剂一直是一个巨大的挑战。
先前，本研究团队已经发现了一系列小分子化合物（如UCB-6786, UCB-5307, UCB-9260），它们能够通过结合到TNF三聚体的核心，稳定一种扭曲的、不对称的TNF三聚体构象，从而将每个TNF三聚体所能结合的TNFR1受体数量从三个减少到两个。然而，这种小分子稳定下的扭曲TNF三聚体如何具体影响其与TNFR1的相互作用，进而破坏信号传导的详细机制尚不明确。
因此，本研究旨在通过生物化学和结构生物学手段，深入表征这些小分子抑制剂稳定下的TNF-TNFR1复合物。具体目标包括：1）定量评估小分子对TNF与TNFR1结合亲和力的影响，特别是对第三个受体结合位点的影响；2）解析小分子抑制剂存在下TNF-TNFR1复合物的晶体结构，从原子层面揭示其作用机制；3）探究TNF-TNFR1在溶液中形成信号传导网络（簇）的机制，并阐明小分子如何破坏这一过程。这些研究将为理解TNF信号传导的分子基础以及开发新型小分子TNF抑制剂提供关键见解。
第三， 详细研究流程
本研究包含三个主要且相互关联的实验流程：结合亲和力与化学计量分析、复合物晶体结构解析、以及体外网络组装分析。
流程一：结合亲和力与化学计量分析 此流程旨在定量评估小分子化合物（以UCB-0595为代表）对TNF与TNFR1结合的影响。 1. 研究对象与样品制备：研究使用重组人源TNF（hTNF，残基77-233）和人源TNFR1胞外域（hTNFR1，残基41-201）。将hTNF与小分子UCB-0595（10倍摩尔过量）预孵育过夜，确保形成完全结合的复合物。对照组使用等量DMSO处理。 2. 离子淌度质谱分析：这是本研究的核心定量方法。将hTNF（含或不含化合物）与一系列浓度梯度的hTNFR1混合孵育。使用配备Advion Triversa Nanomate源的Waters Synapt G2 Q-TOF质谱仪进行分析。IMS-MS能够根据质荷比（m/z）和离子在气体中运动的淌度（与形状、尺寸相关）分离不同受体结合状态的TNF复合物（如结合0、1、2、3个受体的TNF）。 3. 数据处理与亲和力计算：从质谱数据中提取各物种（TNF-0R， TNF-1R， TNF-2R， TNF-3R）的离子计数，并归一化为摩尔分数。研究者开发了一种基于Python的算法，通过求解平衡方程，拟合实验数据，从而推导出三个连续受体结合事件（TNF + R ⇌ TNF-1R； TNF-1R + R ⇌ TNF-2R； TNF-2R + R ⇌ TNF-3R）各自的解离常数（Kd1， Kd2， Kd3）。这种方法首次实现了对TNF三聚体上三个独立受体结合位点亲和力的直接测量。 4. 表面等离子共振验证：为了补充IMS-MS的结果，研究者设计了SPR实验来专门观察第三个受体的结合。首先将TNFR1固定于CM5芯片表面，然后注入高浓度TNF（预孵育或不预孵育UCB-0595）形成部分饱和的复合物。最后，滴定注入可溶性TNFR1，观察第三个受体结合的信号。此实验旨在定性验证小分子对第三个受体结合动力学的影响。
流程二：复合物晶体结构解析 此流程旨在从原子分辨率揭示小分子如何改变TNF三聚体结构及其与受体的结合模式。 1. 研究对象与复合物制备：由于人源TNF-TNFR1复合物结晶困难，研究转向使用鼠源TNF（mTNF，与人源TNF高度同源）与人源TNFR1截短体（残基41-184，缺失部分CRD4）进行共结晶。分别制备了不含小分子的mTNF-hTNFR1复合物以及含有小分子UCB-4433的mTNF-hTNFR1复合物。 2. 晶体生长与数据收集：通过悬滴气相扩散法获得两种复合物的晶体。不含小分子的复合物晶体在2.0 M硫酸铵，0.1 M Bis-Tris pH 5.5条件下生长；含UCB-4433的复合物晶体在800 mM酒石酸钾钠，0.5% PEG5000 MME，100 mM Tris pH 8.5条件下生长。X射线衍射数据分别在Advanced Light Source（5.0.1线站）和Argonne Photon Source（21-ID-F/-G线站）收集。 3. 结构解析与精修：使用分子置换法（Phaser程序）解析结构。初始模型基于已发表的hTNF结构（apo态和化合物结合态）以及未复合的hTNFR1结构。随后使用Coot进行手动模型搭建和修正，并使用Refmac进行迭代精修。最终结构经过MolProbity验证后提交至蛋白质数据库（PDB ID：7kp7 为无化合物复合物，7kp8 为UCB-4433结合复合物）。作为对照，还解析了单独hTNF与UCB-4433结合的结构（PDB ID：7kp9）。
流程三：体外网络组装分析 此流程旨在模拟并研究TNF与TNFR1在溶液中形成高级寡聚网络（可能模拟细胞表面信号簇）的过程，以及小分子的抑制作用。 1. 研究对象：使用全长hTNF和两种不同长度的hTNFR1胞外域：长型（41-201，含完整CRD4）和短型（41-184，缺失部分CRD4）。 2. 沉淀/聚集实验：将hTNF与不同比例、不同浓度的hTNFR1混合，通过测量600 nm波长处的吸光度（A600）来定量蛋白质聚集/沉淀的程度。首先比较了长型和短型受体与TNF混合后的沉淀差异。然后系统研究了TNF与长型受体在不同摩尔比例和总浓度下的聚集动力学。 3. 小分子抑制实验：在固定TNF浓度下，将其与不同比例的hTNFR1混合，并预先加入小分子UCB-9260或DMSO对照，监测A600随时间或随受体比例的变化，评估小分子对网络组装的抑制作用。 4. 基于凝胶密度测定的定量分析：为了更精确地研究小分子对受体-受体相互作用（网络组装的驱动力）的影响，研究者设计了另一实验。将TNF与受体比例固定为1：3.2（确保TNF被三个受体饱和），但改变复合物的总浓度。混合孵育后，离心去除沉淀，对上清液中可溶的TNF进行SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色，通过凝胶成像密度分析定量沉淀的TNF比例，从而绘制聚集曲线。 5. 细胞信号验证：使用NF-κB报告基因细胞实验（HEK-Blue™细胞），在两种不同浓度（10 pM和100 pM）的TNF刺激下，评估UCB-9260抑制TNF信号传导的效价（IC50）和效能变化，以关联体外生化数据与细胞水平的功能抑制。
第四， 主要研究结果
流程一结果： IMS-MS定量分析揭示了关键发现。在无小分子存在时，TNF三聚体与TNFR1的结合表现出明显的协同性。前两个受体的结合亲和力非常高（Kd1 ~10-20 pM），与文献报道的平均值一致。然而，第三个受体的结合亲和力显著降低，Kd3约为0.22 nM，比前两个弱约10倍。这表明TNF三聚体上三个结合位点并非完全等效，存在负协同效应。
当TNF被小分子UCB-0595饱和结合后，情况发生剧变。前两个受体的结合亲和力基本保持不变（Kd1=0.04 nM， Kd2=0.19 nM），但第三个受体的结合亲和力急剧下降了超过4个数量级，Kd3从0.22 nM恶化至9.6 μM。多个化合物均显示出类似效应（亲和力降低约5个数量级）。SPR实验虽因复合物解离过快未能精确计算Kd，但直观显示，在化合物存在下，第三个受体的结合速率显著降低，且形成的TNF-TNFR1-化合物复合物对可溶性受体的竞争置换更稳定。这些数据共同证实，小分子通过稳定扭曲的TNF构象，特异性地、极大地削弱了第三个受体结合位点的亲和力，从而在功能上将TNF从三价配体转变为二价配体。
流程二结果： 晶体结构提供了直接的视觉证据。不含小分子的mTNF-hTNFR1复合物结构显示，TNF三聚体呈标准的三重对称结构，三个单体受体（monomeric）分别结合在三个对称的位点上（图2a， b），与已知的TNFβ-TNFR1复合物结构相似。
而含小分子UCB-4433的复合物结构则呈现出截然不同的景象（图2c， d）。首先，正如预期，只有两个受体结合到TNF三聚体上。对第三个（A-C单体间）结合位点的分析显示，由于小分子结合导致的构象扭曲，单体A相对于单体C发生了显著的扭转和位移（位移达6.2-7.8 Å），使得该位点无法容纳一个受体同时桥接两个单体。其次，也是最关键的发现：结合上去的两个受体并非以单体形式存在，而是以二聚体（dimeric）形式结合。这种受体二聚体的排列方式与已发表的、通过预配体组装域（Pre-Ligand Assembly Domain, PLAD）相互作用的TNFR1二聚体晶体结构（PDB：1ncf）高度相似（RMSD 1.4 Å）。在晶体晶格中，这些TNF-受体二聚体单元进一步通过受体-受体相互作用延伸形成了一条弯曲的螺旋链（图3）。该结构直观地展示了小分子如何通过诱导TNF构象扭曲，破坏第三个受体结合位点，并揭示了TNFR1以二聚体形式参与复合物组装的可能性。
流程三结果： 溶液中的网络组装实验提供了功能上的印证和延伸。研究发现，当使用含完整CRD4结构域的长型TNFR1（41-201）与TNF混合时，会迅速发生依赖于比例的蛋白质聚集/沉淀。沉淀的触发点发生在TNF三聚体与受体的比例达到约1：2（即接近第三个受体开始结合）时，并在比例达到1：3（完全饱和）时达到平台。使用缺失部分CRD4的短型受体（41-184），即使在饱和比例下也完全不发生聚集。这表明：（1）TNF与TNFR1在溶液中能自发组装成有序的网络结构，这可能模拟了细胞表面的信号簇；（2）网络组装需要第三个受体的结合作为触发；（3）CRD4结构域在此过程中起着至关重要的作用。
小分子UCB-9260能够显著抑制这种网络组装。在较低受体比例下，它能完全阻止聚集，将聚集起始点从TNF：TNFR1 ≈ 1：2推迟到约1：2.4。在固定高比例（1：3.2）但改变总浓度的实验中，小分子使聚集曲线向右移动，表明它提高了触发网络组装所需的复合物浓度阈值，即削弱了驱动网络组装的受体-受体相互作用。细胞实验进一步支持了这一发现：在高浓度TNF（100 pM）刺激下，UCB-9260的抑制效能和效价均有所下降，这与体外实验中高浓度复合物可部分克服小分子抑制的现象一致。
第五， 研究结论与意义
本研究得出结论：所研究的小分子TNF抑制剂通过稳定TNF三聚体的一种扭曲构象，特异性地、大幅度地降低其与第三个TNFR1分子的结合亲和力，从而将TNF从三价配体转变为二价配体。结构生物学证据显示，在这种抑制状态下，TNF仅能结合两个以PLAD样二聚体形式存在的TNFR1。更重要的是，溶液实验表明，TNF与TNFR1的完全结合（三受体结合）是触发其通过受体-受体相互作用（可能涉及CRD4）组装成大型信号网络的关键步骤。
基于这些发现，研究者提出了一个修正的TNF信号传导模型（图6）：在细胞膜上，TNFR1可能以预形成的二聚体（如PLAD二聚体）存在。低浓度TNF时，通过高亲和力的第一、第二个结合位点形成“TNF-双受体二聚体”微型复合物。随着TNF浓度升高，当第三个（较弱）受体结合事件发生时，会诱导受体构象变化（可能涉及CRD4），促使这些微型复合物通过受体-受体相互作用耦联，组装成平面延展的大型信号网络，从而启动下游信号。小分子抑制剂的作用在于，它通过破坏第三个结合位点，阻止了网络组装的“触发”步骤，即使在高浓度下，也只能形成不完整的、信号传导能力减弱的网络。
本研究的科学价值在于：1）首次直接测量并证实了TNF三聚体上三个受体结合位点存在不对称的亲和力（负协同效应）；2）首次在结构上展示了小分子抑制剂稳定下的TNF-TNFR1复合物，揭示了受体以二聚体形式参与结合；3）通过精巧的体外实验，将TNF-TNFR1的生化相互作用与高级簇状网络组装直接联系起来，并明确了CRD4的关键作用；4）提出了一个整合了配体结合协同性、受体预组装和网络触发机制的更精细的TNF信号传导模型。
其应用价值在于为开发新型小分子TNF抑制剂提供了清晰的机制蓝图和验证平台。研究表明，完全阻断一个或多个受体结合位点的小分子有望更有效地抑制信号。这些发现对于治疗类风湿性关节炎、克罗恩病等自身免疫性疾病的新型口服小分子药物的研发具有重要指导意义。
第六， 研究亮点
第七， 其他有价值的内容
研究中对PLAD二聚体在信号网络中的角色进行了深入讨论。晶体结构中观察到的由PLAD样二聚体介导的螺旋状TNF-受体链（图3）与细胞膜的平面特性不符，提示在细胞表面形成功能性信号网络时，受体二聚体可能需要发生构象重排。研究者通过结构建模推测，包含完整CRD4的长型受体二聚体可能采用不同于已知PLAD二聚体（1ncf）或反向平行二聚体（1ext）的构象来参与平面网络的构建。这为未来研究TNFR1在膜上的精确组装方式指明了方向。
此外，研究也客观地讨论了当前工具化合物的局限性，如在极高TNF浓度下抑制效能会下降，这与其作用机制（提高第三受体结合的能垒，而非完全阻断）相符，并提示未来寻找能更彻底阻断受体结合的小分子可能获得更佳疗效。