本研究报告介绍了一项发表于《Advanced Healthcare Materials》期刊2026年的原创研究。该研究由荷兰特温特大学（University of Twente）和拉德堡德大学医学中心（Radboud University Medical Center）的研究团队合作完成，主要作者包括Laurens R. Spoelstra、Fleur R. Semmekrot、Nuno Araújo-Gomes、Daniël Wijnperle等，通讯作者为Loes. I. Segerink、Séverine Le Gac和Marcel Karperien。
学术背景 本研究属于生物医学工程与风湿病学交叉领域，具体聚焦于关节炎的体外模型开发。在健康的滑膜（Synovium）组织中，成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-like Synoviocytes, FLS）、巨噬细胞和内皮细胞等通过复杂的相互作用维持关节稳态。然而，在骨关节炎（Osteoarthritis, OA）和类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）等疾病中，滑膜会发生炎症（Synovitis）和纤维化，其特征包括FLS活化与迁移、炎症介质释放、血管新生以及免疫细胞浸润等。理解这些细胞间的相互作用对于揭示关节炎的发病机制和开发新疗法至关重要。然而，现有的研究模型存在局限：动物模型生理相关性不足；传统的二维细胞培养过于简化，缺乏多细胞环境；而已有的少数“芯片上的滑膜”（Synovium-on-chip, SoC）模型，或者缺乏关键的常驻免疫细胞成分，或者使用了较厚的分隔膜（如50微米），限制了细胞间的直接接触与迁移。因此，研究团队旨在开发一个更具生理相关性的SoC平台，以可控的方式研究FLS、巨噬细胞和内皮细胞之间的动态相互作用，特别是迁移驱动的过程。
研究目标 本研究的主要目标是设计、构建并验证一个能够模拟滑膜衬里层和衬里下层的分区化“芯片上的滑膜”平台。该平台需具备以下特点：1）集成患者来源的FLS、巨噬细胞样细胞和内皮细胞的三重共培养；2）使用超薄（2微米）、微孔（5微米孔径）的聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane， PDMS）膜作为分隔，以允许细胞迁移和直接相互作用；3）在无需外源性刺激下，能重现关节炎中关键的细胞行为（如FLS迁移、血管重塑）；4）能够响应促炎因子（如肿瘤坏死因子-α， TNF-α）并建立炎症表型。
详细工作流程 本研究主要包括平台开发、模型建立与验证、机制探索以及炎症模型构建四个主要阶段，涉及了芯片制造、细胞培养、成像分析、生物化学检测等多种技术。
第一阶段：SoC平台的设计与制造 研究团队设计了一种全PDMS的双腔室芯片。芯片的核心创新在于两个培养腔室（顶部和底部）之间水平放置的一片2微米厚、带有5微米直径圆形孔洞（间距30微米）的微孔PDMS膜。这种超薄多孔结构旨在紧密模拟体内滑膜衬里层与富含血管的衬里下层之间的解剖界面，并允许细胞穿膜迁移和直接接触。芯片顶部还设计有圆柱形储液池层，以确保上下腔室培养基的完全分离和充分的营养供应。制造工艺基于团队先前的工作进行了优化，实现了晶圆级生产（一次可生产多达20个芯片），并减少了手动对准步骤。膜的制作涉及光刻、PDMS旋涂和反应离子蚀刻等微加工技术。
第二阶段：三重共培养模型的建立与优化 研究团队使用了来自一位61岁晚期OA女性患者的原代FLS、红色荧光蛋白标记的人脐静脉内皮细胞（RFP-HUVECs）以及THP-1单核细胞系来源的巨噬细胞（作为常驻滑膜巨噬细胞的模型）。细胞接种流程经过系统优化：第-1天，FLS被接种在顶部腔室的膜上；第0天，通过两步法将HUVECs接种在底部腔室，使其覆盖底部和膜的下表面，形成内皮管腔；第3天，将PMA诱导分化的THP-1巨噬细胞接种在顶部腔室的FLS层之上。所有细胞在芯片中共同培养长达10天。为促进细胞粘附，芯片通道预先用聚多巴胺和I型胶原蛋白进行了包被。
第三阶段：细胞行为与相互作用的表征 利用共聚焦反射显微镜和荧光显微镜对模型进行了一系列表征。这包括：1）验证所有三种细胞类型在芯片中的整合与定位；2）通过免疫荧光染色确认细胞特异性标记物的表达（FLS的Cadherin-11， HUVECs的VE-cadherin， THP-1巨噬细胞的CD163），以证明细胞表型的维持；3）动态监测内皮管腔的形态变化。为了量化内皮管腔的重塑，研究团队开发了一个自定义的MATLAB脚本，通过分析低倍荧光图像来测量管腔的“投影宽度”。统计分析采用线性混合模型（Linear Mixed Model）。4）使用4 kDa的FITC-葡聚糖进行灌注实验，评估内皮屏障功能。
第四阶段：FLS迁移诱导的血管重塑机制探究 为探究内皮管腔重塑的原因，研究团队使用CellTracker Green标记FLS进行示踪。通过3D共聚焦显微镜成像，在培养第10天直接观察FLS在芯片中的空间分布。此外，为了定量分析内皮细胞在共培养过程中发生的表型变化，研究人员采用了一种基于机器学习的方法。他们使用CellPose软件（一个用于细胞分割的深度学习模型），针对本研究中VE-cadherin染色图像训练了一个定制化的模型。利用该模型，他们对培养第3、5、10天时，位于底部腔室“地板”和“膜”两个位置的内皮细胞进行了自动分割，并定量分析了细胞面积、纵横比（Aspect Ratio）和Feret角度（取向角）等形态学描述符。统计分析使用Kruskal-Wallis ANOVA和Dunn’s事后检验。
第五阶段：炎症模型的建立与验证 为了模拟关节炎中的滑膜炎，研究团队从第6天开始，每天向SoC模型的顶部腔室添加10 ng/mL的TNF-α进行刺激，持续至第10天。对照组则不添加TNF-α。在第7至10天，每日收集顶部腔室的培养基上清。使用Luminex多重细胞因子检测技术，分析了白细胞介素-6（IL-6）、IL-8、IL-1β、CC趋化因子配体2（CCL2）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和干扰素-γ（IFN-γ）的分泌水平。此外，通过免疫荧光染色检测了炎症条件下内皮细胞表面细胞间粘附分子-1（ICAM-1）的表达变化。
主要研究结果 1. 成功建立并维持三重共培养模型。 共聚焦成像证实，THP-1巨噬细胞和FLS位于膜的上侧，而HUVECs形成的内皮管腔位于膜的下侧，成功模拟了滑膜的层次结构。所有细胞类型在长达10天的培养中均保持了活力，并表达了各自的特征性标记物（Cadherin-11， VE-cadherin， CD163），表明模型具有良好的细胞表型保真度。
2. 发现并证实了FLS迁移诱导的自发性内皮管腔重塑。 在没有任何外部机械或生化刺激的情况下，三重共培养模型中的内皮管腔从第5天开始发生显著重塑：管腔从紧贴通道壁的矩形逐渐收缩、脱离管壁，形成椭圆形。线性混合模型分析显示，从第6天起，三重共培养组的管腔投影宽度显著小于仅有HUVECs的对照组。通过追踪标记的FLS，研究直接观察到FLS通过膜上的5微米孔洞迁移到了底部腔室，并广泛分布在管腔周围的腔外空间中，形成了FLS包裹内皮管腔的结构。这一自组织过程与滑膜组织学观察以及此前FLS-HUVEC共培养类器官的研究结果一致。FITC-葡聚糖灌注实验表明，重塑后的管腔仍具有屏障功能，但低分子量探针会缓慢渗漏。
3. 揭示了FLS引起的内皮细胞表型转变。 CellPose机器学习图像分析提供了定量证据，表明在与FLS和巨噬细胞共培养的过程中，内皮细胞的形态发生了显著变化。从第3天到第10天，内皮细胞的纵横比持续增加，细胞变得更加细长。到第10天，位于膜附近的内皮细胞表现出比位于地板上的细胞更高的纵横比，并且两个位置的内皮细胞都出现了特定的取向（地板细胞约60度，膜上细胞约130度，相对于芯片水平轴）。这些形态变化在HUVECs单独培养的对照组中并未出现，表明它们是由共培养环境诱导产生的。研究还观察到了从底部腔室向顶部腔室延伸的、表达VE-cadherin的内皮细胞芽（血管出芽现象）。这些结果共同表明，SoC平台中的细胞相互作用触发了动态的内皮表型转变和重塑。
4. 成功构建了炎症表型。 TNF-α刺激有效诱导了SoC模型的炎症反应。Luminex检测结果显示，与未刺激的对照组相比，TNF-α处理组的IL-6、IL-8、CCL2和GM-CSF的分泌水平显著上调（IL-6和IL-8约升高6-10倍，CCL2约升高3倍）。这些细胞因子均与OA和RA的发病机制密切相关。此外，免疫荧光染色显示，TNF-α刺激显著增强了底部腔室内皮细胞上ICAM-1的表达。ICAM-1在介导白细胞粘附和浸润中起关键作用。这些数据共同证实，该SoC模型能够成功模拟关节炎中的滑膜炎特征。
研究结论 本研究成功开发并验证了一个包含常驻免疫细胞成分、基于超薄微孔膜的新型“芯片上的滑膜”平台。该平台能够在体外重现滑膜的关键生物学特征，特别是在没有外源刺激下，自发发生FLS迁移、内皮管腔重塑和内皮细胞表型转变等与关节炎病理相关的动态过程。此外，平台能够响应TNF-α刺激，建立稳定的炎症表型并释放相关细胞因子。这项工作的意义在于提供了一个强大的、可控的体外研究工具，为未来深入探索滑膜在关节炎中的复杂细胞通讯机制、筛选不同FLs或巨噬细胞亚型的作用、以及进行靶向药物开发和个性化医疗研究奠定了坚实的技术基础。
研究亮点 1. 创新的平台设计： 使用了2微米厚、5微米孔径的超薄微孔PDMS膜，极大地促进了细胞间的直接物理相互作用和迁移，更贴近体内无膜分隔的生理状况。 2. 完整的细胞微环境： 首次在SoC模型中同时整合了患者来源的FLS、内皮细胞和巨噬细胞（THP-1来源）三重共培养，包含了关节炎病理中关键的免疫组分。 3. 揭示了自发的动态相互作用： 研究不仅建立了静态共培养，更重要的是观察并证实了由FLS迁移驱动的、自发的内皮组织重塑，这是对关节炎病理过程的有力体外模拟。 4. 先进的定量分析方法： 结合了自定义的MATLAB图像分析脚本、线性混合模型统计以及基于CellPose机器学习的内皮细胞形态定量分析，为细胞行为提供了客观、精细的量化数据支持。 5. 验证了疾病建模能力： 通过TNF-α刺激实验，证明了该平台可用于建立和研究生理性相关的关节炎炎症模型，具备应用于药物筛选和机制研究的潜力。
其他有价值的内容 研究在讨论部分也坦诚地指出了当前模型的局限性，并提出了未来的改进方向：1）细胞来源：目前仅使用了一位OA患者的FLs和一个巨噬细胞系（THP-1）。未来需要使用来自不同疾病状态（OA、RA、健康）的多种原代FLs，以及从患者外周血单个核细胞（PBMCs）分化的更成熟、疾病相关的巨噬细胞亚型，以增强模型的生理相关性和普适性。2）力学刺激：当前的模型缺乏关节活动中存在的机械力学刺激。未来可通过集成气动驱动腔室，实现对膜的动态拉伸，以研究机械力在滑膜生物学和关节炎中的作用。3）免疫细胞功能：本研究未深入探讨THP-1巨噬细胞的具体功能状态，未来需要详细研究FLs-巨噬细胞的相互作用网络。这些前瞻性的思考为该技术的持续发展和应用指明了清晰的路径。