报告：一项基于永生化人类椎间盘细胞的组织工程研究：构建椎间盘再生与融合新模型
本报告旨在详细解析由Yi Zhu、Qing Liu等学者团队在《Advanced Healthcare Materials》期刊（发表于2025年）上报道的一项原创性研究。该研究聚焦于椎间盘退行性变（Intervertebral Disc Degeneration， IVDD）这一全球性健康难题，创新性地结合了细胞永生化技术、生物因子刺激与生物相容性支架，成功构建了两种重要的临床前模型：椎间盘再生模型与椎间融合模型，为椎间盘疾病的治疗提供了全新的研究工具与潜在策略。
一、 研究团队与发表信息
本研究是一项大型国际合作成果。主要作者包括Yi Zhu（苏州大学附属第一医院骨科研究所，北京医院国家老年医学中心）、Qing Liu（芝加哥大学医学中心分子肿瘤学实验室，中南大学湘雅医院）、Liangyuan Wen（北京医院国家老年医学中心）和Tong-Chuan He（芝加哥大学医学中心分子肿瘤学实验室及颅面生物学与发展实验室）。通讯作者为Liangyuan Wen和Tong-Chuan He。研究团队汇聚了来自中国、美国多所顶尖医学院校和研究机构，以及巴基斯坦农业大学的科研人员，涵盖了骨科、生物材料、分子生物学等多个领域。该研究成果以开放获取的形式发表于Wiley-VCH旗下的《Advanced Healthcare Materials》期刊，具体发表日期为2025年，文章在线发表日期为2025年3月7日。
二、 学术背景与研究目标
椎间盘是位于脊柱椎体之间的特殊无血管结构，由中央富含水分的髓核（Nucleus Pulposus， NP）、周围坚韧的纤维环（Annulus Fibrosus， AF）以及连接椎体的软骨终板组成。NP富含蛋白聚糖（Proteoglycans），通过吸水维持膨胀压，起到液压减震的作用；而AF则由高度有序的胶原纤维层状结构组成，负责抵抗张力和压力，束缚NP并维持椎间盘的结构完整性。IVDD通常始于NP脱水，导致椎间盘高度丢失、功能减退，进而引发慢性腰痛（Low Back Pain， LBP），给社会带来沉重的经济负担。当前临床治疗主要集中在症状缓解或晚期的手术干预（如椎间盘切除、脊柱融合等），但这些方法治标不治本，无法实现组织再生。
近年来，组织工程为IVDD的治疗带来了曙光。成功的组织工程需要三大要素：功能性的祖细胞/细胞、生物相容性支架和促进细胞分化/增殖的生物因子。然而，使用原代人类NP细胞和AF细胞面临巨大挑战：获取困难、增殖能力有限、体外培养寿命短，严重制约了其基础研究与临床转化应用。
因此，本研究的核心目标是：1）建立可长期传代、保持细胞特性且安全可控的永生化人类NP细胞和AF细胞系，作为研究椎间盘细胞生物学的宝贵工具；2）利用这些细胞，结合有效的生物因子（如骨形态发生蛋白BMPs）和先进的生物材料支架，构建功能性的椎间盘再生模型；3）探索这些细胞在脊柱融合（一种常见手术）中的应用潜力。
三、 详细研究流程与方法
研究流程可分为几个相互关联的关键阶段，涉及了细胞工程、分子生物学、材料科学和动物实验等多个层面。
第一阶段：建立可逆永生化的人类NP细胞与AF细胞系 1. 细胞获取与永生化：研究首先从商业渠道获得原代人类NP细胞（hNPCs）和AF细胞（hAFCs）。为了解决原代细胞增殖能力有限的问题，研究者使用了一种自制的慢病毒载体pMLV-hTERT。该载体携带人端粒酶逆转录酶（Human Telomerase Reverse Transcriptase, hTERT）基因，其表达可延长细胞端粒，实现永生化。同时，载体设计巧妙，将hTERT基因与潮霉素抗性基因通过自切割的E2A肽连接，并两侧 flanked 有Flp重组酶识别靶点（Flp Recognition Target, FRT）位点。这意味着永生化可以通过后续导入Flp重组酶来逆转。 2. 细胞筛选与鉴定：用携带hTERT的慢病毒感染原代细胞，并经潮霉素筛选后，成功获得了永生化的人NP细胞（iHNPCs）和人AF细胞（iHAFCs）。两种细胞均可稳定传代超过30代。形态学上，iHAFCs呈成纤维细胞样，生长较快；iHNPCs则更圆。 3. 细胞特性与安全性验证： * 标志物表达：通过实时定量PCR分析，证实iHAFCs和iHNPCs分别高表达AF细胞特异性标志物（如某些胶原基因）和NP细胞特异性标志物（如SOX9、聚集蛋白聚糖ACAN等），表明永生化过程保留了细胞类型特异性。 * 非致瘤性验证：将稳定表达萤火虫荧光素酶（fluc）的iHAFCs和iHNPCs皮下注射到裸鼠体内，无论是否用Flp去除hTERT，细胞均未形成肿瘤（作为对照的骨肉瘤细胞143B则快速生长并形成强信号），证明了细胞的安全性。 * 可逆性验证：用腺病毒（Ad）载体将Flp重组酶（Ad-Flp）导入永生化细胞，成功去除了hTERT表达。细胞增殖活力显著下降，细胞周期停滞在G1期的比例增加，克隆形成能力减弱，这证实了永生化是可逆的，增强了细胞作为研究工具的可控性。
第二阶段：探究永生化细胞的分化潜能 1. iHAFCs的成骨潜能：基于团队前期研究发现BMP9是诱导成骨分化的最强因子，本研究用Ad-BMP9刺激iHAFCs。结果在体外表现为：早期成骨标志物碱性磷酸酶（ALP）活性显著升高；经矿化培养基培养后，茜素红S染色显示大量矿化结节形成；成骨关键调控因子（RUNX2， OSX）和标志物（骨钙素OCN， 骨桥蛋白OPN， I型胶原COL1A1）的mRNA表达显著上调。 2. iHNPCs的软骨形成潜能：已知BMP2能诱导间充质干细胞软骨分化。用Ad-BMP2刺激iHNPCs，在软骨诱导培养基中进行微团块培养或三维（3D）GelMA水凝胶培养。结果显示：阿尔新蓝染色和番红O染色均呈强阳性，表明产生了大量富含蛋白聚糖的软骨基质；软骨形成关键调控因子SOX9以及标志物ACAN和II型胶原（COL2A1）的表达显著上调。值得注意的是，iHAFCs在同样条件下未显示明显的软骨形成能力，而iHNPCs的成骨潜能也很有限，这突出了两种细胞功能特化的差异。
第三阶段：生物相容性支架评估 研究选用了两种生物材料：一是FDA已批准用于肌肉骨骼手术的聚柠檬酸辛二醇酯（Poly(1，8-octanediol-co-citric acid), POC）及其复合物（如聚乙二醇柠檬酸-co-N-异丙基丙烯酰胺， PPCN），二是广泛使用的明胶甲基丙烯酰（Gelatin Methacryloyl, GelMA）水凝胶。实验通过将表达绿色荧光蛋白（GFP）和分泌型高斯荧光素酶（Gluc）的细胞（iHAFCs与PPCN-g混合， iHNPCs与GelMA混合）接种到3D打印的POC圆盘状支架上。通过监测GFP荧光和培养液中Gluc活性，证实了细胞在支架上能良好存活、附着和增殖超过10天。共接种实验也显示，细胞能在支架上形成空间分布（iHNPCs/GelMA在中心， iHAFCs/PPCN-g在周边），为构建仿生结构奠定了基础。
第四阶段：构建椎间盘再生模型（核心创新模型） 这是本研究最具特色的组织工程实践。研究设计并组装了一个仿生的椎间盘样结构： 1. 支架与细胞准备：使用3D打印技术制造一个圆柱形POC支架，中心预留空腔。分别用Ad-BMP2刺激iHNPCs，用Ad-BMP9刺激iHAFCs。 2. 结构组装：将BMP2刺激的iHNPCs与GelMA水凝胶混合，填入支架中心空腔，并用紫外线固化。随后，将BMP9刺激的iHAFCs与热敏性聚合物PPCN-g混合，立即加载到支架的周边、顶部和底部区域。 3. 体内植入与评估：将此组装好的“工程化椎间盘”结构皮下植入裸鼠体内，培养6周。对照组包括只接种GFP对照病毒的细胞组或仅有POC支架组。 4. 结果分析： * Micro-CT成像：实验组（BMP9/iHAFCs + BMP2/iHNPCs）在支架外周区域显示出显著的骨形成，总骨体积和平均高度均显著高于对照组。 * 组织学分析：苏木精-伊红（H&E）染色显示，外周区域形成了新的骨结节，而中心区域则出现了软骨样组织。番红O/固绿染色（特异显示软骨蛋白聚糖）和马松三色染色（区分胶原）进一步证实了中心区域的软骨样组织和外周区域的成熟骨组织，成功模拟了天然椎间盘“外周环骨样/内层软骨样”的结构特征。
第五阶段：构建离体椎间融合模型（拓展应用模型） 为探索iHAFCs在脊柱融合手术中的应用潜力，研究者构建了一个离体模型： 1. 模型制备：从新鲜处死的大鼠身上获取腰椎节段，手术移除目标椎间盘，形成空腔。 2. 细胞治疗：将Ad-BMP9或Ad-GFP感染的iHAFCs与PPCN-g混合，注射到椎间盘移除后的空腔内。 3. 体内培养与评估：将这些处理过的脊柱节段皮下植入裸鼠体内，培养6周。以保留原生椎间盘的节段和仅移除椎间盘但不注射细胞的节段作为对照。 4. 结果分析： * Micro-CT成像：BMP9/iHAFCs治疗组在两个椎体终板之间形成了显著的新骨结构，骨密度和相对骨体积是对照组的2-3倍。 * 组织学分析：H&E和马松三色染色显示治疗组有空腔内有成熟的骨形成并与终板融合。改良PAS染色显示治疗组软骨组织显著减少，进一步证实了骨性融合的发生。
四、 主要研究结果及其逻辑关联
本研究取得了一系列系统且相互印证的结果： 1. 成功建立安全可控的细胞工具：获得了可长期稳定培养、表达各自特异性标志物、非致瘤且永生化状态可逆的iHAFCs和iHNPCs。这一结果是所有后续研究的基础，解决了原代细胞来源稀缺和寿命短的瓶颈。 2. 明确了细胞特化的分化潜能：iHAFCs在BMP9刺激下表现出强大的成骨分化能力（体外ALP升高、矿化结节形成、成骨基因上调；体内成骨），而iHNPCs在BMP2刺激下表现出优异的软骨形成能力（体外微团块及3D水凝胶中软骨基质沉积、软骨基因上调）。这一发现为针对性地利用不同细胞类型进行组织构建提供了理论依据。细胞功能的特异性分化是构建仿生复合结构的前提。 3. 验证了支架的相容性与可操作性：POC、PPCN-g和GelMA材料与细胞相容性好，支持细胞存活和空间分布，使得构建复杂三维结构成为可能。这是从二维培养迈向三维组织工程模型的关键一步。 4. 成功构建功能化椎间盘再生模型：将上述发现整合，即“BMP9刺激的成骨性iHAFCs置于外周” + “BMP2刺激的软骨性iHNPCs置于中心” + “POC三维支架”，体内实验成功再生了同时含有骨样组织和软骨样组织的复合结构，高度模拟了椎间盘（尤其是退变或老化过程中纤维环趋于骨化、髓核保持软骨特性的）组织特征。该模型是本研究核心成果的集中体现。 5. 拓展了细胞在脊柱融合中的应用：利用iHAFCs的强成骨能力，在离体脊柱节段模型中实现了有效的椎间骨性融合，证明了其在修复大段骨缺损或促进脊柱融合方面的潜在治疗价值。这是对核心细胞工具应用场景的重要拓展。
五、 研究结论与价值
本研究得出结论：通过hTERT介导的可逆永生化技术获得的人iHAFCs和iHNPCs，是研究椎间盘细胞生物学和开发组织工程疗法的宝贵细胞来源。结合特定的生物因子（BMP9和BMP2）以及生物相容性支架（如POC），能够成功构建出模拟天然椎间盘结构的再生模型，并展示了其在椎间融合应用中的潜力。
科学价值： 1. 提供了稳定、可靠的人类椎间盘细胞研究模型，极大地便利了关于NP和AF细胞生理、病理、分子调控机制的基础研究。 2. 展示了一种整合细胞、因子、支架的综合性组织工程策略，为椎间盘再生提供了新的思路和可行性验证。 3. 构建的两种模型（再生模型和融合模型）可作为强大的临床前研究平台，用于筛选促进NP基质合成或AF修复的生物因子、药物，或测试新型支架材料。
应用价值： 1. 治疗潜力：为最终开发基于自体细胞（经永生化扩增后，可去除永生化基因）或同种异体细胞（结合免疫调节）的椎间盘再生或脊柱融合疗法奠定了坚实的实验基础。 2. 工具价值：iHAFCs和iHNPCs可作为标准化工具，用于药物筛选、毒性测试、基因功能研究等生物医药研发环节。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
文中还简要讨论了研究的局限性，体现了作者的严谨性：例如，hTERT永生化无法完全复制自然衰老过程；POC支架在承重力学性能方面仍需进一步优化以适应临床需求；体内研究缺乏对长期炎症反应和机械刺激影响的深入分析等。这些为后续研究指明了方向。此外，文章在讨论部分结合了最新的单细胞RNA测序研究发现来阐释NP细胞的异质性和起源，将本研究置于更广阔的学术背景中，增加了研究的深度。