学术研究报告：基于链表达定制的质粒设计在细胞系开发中增强单克隆及双特异性抗体生产

作者及机构
本研究由Shenghai Liu（百济神州（上海）有限公司）、Qianqian Chen（百济神州（上海））、Lujia Peng（百济神州（北京））等13位作者合作完成，通讯作者为Jing Song（jing.song@beigene.com）。研究发表于*Biotechnology Journal*（2025年8月），DOI: 10.1002/biot.70104。

学术背景
本研究属于生物制药领域的细胞系开发（Cell Line Development, CLD）方向，聚焦于通过优化质粒设计提升中国仓鼠卵巢（Chinese Hamster Ovary, CHO）细胞生产治疗性抗体（如单克隆抗体mAbs和双特异性抗体bsAbs）的产量与质量。CHO细胞因其悬浮培养适应性、高蛋白产量及类人翻译后修饰能力成为主流宿主细胞，但复杂抗体（如不对称bsAbs）的生产常面临链表达失衡导致的低纯度问题。传统随机整合或转座子（transposon）系统虽简化了流程，但质粒中基因拷贝数（gene copy number）和构型（gene configuration）对产量与纯度的影响机制尚不明确。本研究旨在通过系统性实验，提出定制化质粒设计策略，解决上述挑战。

研究流程与实验方法
1. 稳定池开发（Stable Pool Development）
- 宿主细胞与质粒构建：使用GS敲除（GS−/−）CHO细胞（HD-Biop3），通过电穿孔导入含不同轻重链（HC/LC）拷贝数与排列顺序的质粒（如T01-T10，见表1），启动子为CMV。
- 筛选与培养：转染后24小时，细胞在无谷氨酰胺培养基中扩增，通过14天补料分批培养（fed-batch）评估产量（titer）和比生产率（qp）。

1. 单细胞克隆（Single Cell Cloning）

   • 通过流式细胞分选将单细胞沉积至96孔板，72小时内时间推移成像确认单克隆性，扩增后评估生产性能。
     

2. 瞬时表达（Transient Expression）

   • 采用聚乙烯亚胺（PEI）介导的瞬时转染，评估不同质粒构型下各链（如knob链、hole链）的表达平衡性。
     

3. 数据分析

   • mRNA水平检测：通过实时定量PCR（RT-qPCR）测定HC/LC mRNA表达量，以β2-微球蛋白（B2M）为内参。
     
   • 产物质量分析：采用尺寸排阻色谱（SEC）、非还原/还原毛细管凝胶电泳（CGE-NR/CGE-R）和阳离子交换色谱（CEX）评估抗体纯度与聚合体水平。
     

主要结果
1. 基因拷贝数与构型的影响
- 产量提升：增加LC拷贝数（如L-L-H-H构型）显著提高mAb产量（图1c），但HC过量（如L-H-H）会降低SEC纯度（图1e）。
- mRNA相关性：LC mRNA水平与产量呈强正相关（R=0.95, p<0.001），而LC/HC mRNA比值与聚合体水平负相关（R=0.93, p<0.001）（图2）。

1. 单质粒系统的优势

   • 对于不对称bsAbs（如Knob-into-Hole结构），将所有链整合至单一质粒（如L-K-H构型）比双质粒系统产量提高40%，纯度提升至>96%（图3h-i）。
     

2. 低表达链的额外拷贝策略

   • 若某链（如LC）表达不足导致纯度低（50-70%），在质粒中添加其额外拷贝可使纯度提升至>90%（图4f-g），且位置不影响效果。
     

3. 案例验证

   • 在bsAb E的开发中，通过密码子优化（codon optimization）和额外knob链拷贝，最终获得高纯度（>96%）且产量稳定的细胞系（图5i-j）。
     

结论与价值
本研究提出了一套基于转座子系统的质粒设计策略：
1. 科学价值：揭示了质粒中基因拷贝数与构型通过mRNA水平调控抗体产量与纯度的机制，填补了转座子平台中链表达平衡研究的空白。
2. 应用价值：单质粒整合和低表达链追加拷贝的方法可显著加速复杂抗体（如bsAbs）的细胞系开发，降低下游纯化成本，适用于工业化生产。

研究亮点
1. 创新性发现：首次证实单质粒系统在转座子平台中对bsAb产量与纯度的双重优化作用。
2. 方法学优化：结合瞬时表达评估与稳定池开发，形成快速预测纯度的标准化流程（图6）。
3. 普适性策略：提出的“额外拷贝追加”方案可推广至其他表达失衡的复杂蛋白。

其他价值
研究未依赖特定基金支持，但通过企业-高校合作（如武汉大学）实现了技术转化，为生物制药行业提供了可落地的解决方案。