基于CRISPR-Cas9技术系统改造枯草芽孢杆菌提升紫穗槐二烯产量的研究

作者及发表信息
本研究由荷兰格罗宁根大学（University of Groningen）的Yafeng Song、Siqi He、Ingy I. Abdallah等团队完成，通讯作者为Wim J. Quax。论文于2021年4月发表于*Journal of Agricultural and Food Chemistry*（J. Agric. Food Chem. 2021, 69, 4785−4794），标题为“Engineering of Multiple Modules to Improve Amorphadiene Production in Bacillus subtilis Using CRISPR-Cas9”。

学术背景
紫穗槐二烯（amorphadiene）是抗疟疾药物青蒿素（artemisinin）的关键前体，其微生物合成是合成生物学的重要研究方向。枯草芽孢杆菌（*Bacillus subtilis*）因其安全的特性和内源的2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径，成为萜类化合物生产的潜在宿主。然而，现有研究多集中于MEP途径的过表达，对其他代谢模块（如竞争分支途径、三羧酸循环TCA等）的影响缺乏系统性探索。本研究旨在通过CRISPR-Cas9技术对枯草芽孢杆菌进行多模块工程化改造，以提升紫穗槐二烯产量。

研究流程与方法
1. CRISPR-Cas9系统的构建与验证
- 目标：建立高效的基因组编辑工具，用于后续多模块改造。
- 方法：采用单质粒系统（phy-cas9），包含化脓链球菌Cas9（spCas9）和靶向引导RNA（gRNA）。编辑模板通过同源重组（HDR）引入突变，验证了该系统在枯草芽孢杆菌中敲除基因（如*ugtp*）和整合外源基因（如绿色荧光蛋白*gfp*）的效率（>90%）。

1. 紫穗槐二烯合成酶（ADS）的工程化

   • 目标：优化紫穗槐二烯合成的限速步骤。
     
   • 方法：
     
     • 将ADS与绿色荧光蛋白（GFP）融合表达（gfpADS），以增强翻译效率。
       
     • 通过CRISPR-Cas9引入已知催化效率提升的突变体（T399S、H448A及双突变体），但实验发现这些突变体在融合形式下活性反而降低（产量仅为野生型的64%-82%）。
       
     • 额外整合一个gfpADS拷贝至基因组（*mpr*位点），使产量提升27%；结合MEP途径过表达后，产量进一步提升125%。
       

2. 竞争分支途径的调控

   • 目标：减少法尼基焦磷酸（FPP）流向竞争途径的消耗。
     
   • 方法：
     
     • 敲除七异戊二烯二磷酸合成酶（*heps*），但产量未显著提升（91%）。
       
     • 通过弱化启动子调控十一异戊二烯焦磷酸合成酶（*upps*）的表达（起始密码子ATG→GTG），使紫穗槐二烯产量提升15%-19%。
       

3. TCA循环模块的工程化

   • 目标：探索中心代谢途径对萜类合成的影响。
     
   • 方法：
     
     • 使用强启动子（*phpaii*）和弱启动子（*pliag*）调控TCA关键酶（如柠檬酸合酶*citZ*、琥珀酸脱氢酶*sdhcab*等）的表达。
       
     • 结果发现：
       
     • *sdhcab*、*sucab*等基因的强表达可提升产量（89%-108%），而弱表达导致产量下降（25%-66%）。
       
     • *citZ*的调控显著抑制菌体生长，导致产量降低至30%-37%。
       

4. 多模块联合优化

   • 策略：整合上述有效改造（双拷贝gfpADS、*upps*弱化、*sdhcab*强表达）至单一菌株（8BSMUS）。
     
   • 结果：48小时摇瓶发酵后，紫穗槐二烯产量从81 mg/L提升至116 mg/L（增幅43%），为枯草芽孢杆菌中未优化培养基条件下的最高报道产量。
     

主要结果与逻辑关系
- CRISPR-Cas9系统：高效编辑为后续多模块改造奠定基础。
- ADS工程：突变体失效提示融合蛋白构象可能影响活性，而拷贝数增加直接缓解了合成瓶颈。
- 分支途径调控：*upps*弱化验证了减少FPP分流策略的有效性。
- TCA循环调控：揭示了中心代谢对萜类合成的复杂影响，尤其是能量和辅因子供应的平衡。
- 联合优化：多模块协同效应显著，证明系统性代谢工程的潜力。

结论与价值
1. 科学意义：
- 首次在枯草芽孢杆菌中通过CRISPR-Cas9实现多模块精准编辑，为复杂代谢网络改造提供范例。
- 揭示了TCA循环对萜类合成的调控机制，填补了枯草芽孢杆菌中相关研究的空白。
2. 应用价值：
- 116 mg/L的产量为工业化生产青蒿素前体提供了优化菌株。
- 研究策略可推广至其他萜类化合物的微生物合成。

研究亮点
1. 方法创新：
- 开发了枯草芽孢杆菌中高效的CRISPR-Cas9编辑系统，支持大片段（2.5 kb）基因组整合。
- 首次将分支途径（*upps*）和TCA循环纳入萜类合成的工程化目标。
2. 发现创新：
- 揭示了ADS突变体在融合表达中的活性丧失现象，为后续酶工程提供警示。
- 明确了TCA酶（如*sdhcab*）的强表达对产量提升的关键作用。

其他有价值内容
- 研究还发现，培养基中添加丙酮酸可显著提升产量，提示碳代谢流调控的重要性。
- 数据支持材料（如菌株和质粒列表）已通过补充信息公开，便于后续研究复现和拓展。

（注：全文术语首次出现时均标注英文原名，如“紫穗槐二烯（amorphadiene）”“法尼基焦磷酸（FPP）”等。）