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一、作者、研究机构与发表信息

本研究由上海市第六人民医院骨科（Department of Orthopedic Surgery, Shanghai Sixth People’s Hospital, Shanghai Jiaotong University）的赵世昌（Shichang Zhao）和张长青（Changqing Zhang）团队牵头，联合同济大学材料科学与工程学院（School of Materials Science and Engineering, Tongji University）的黄文海（Wenhai Huang）课题组，以及美国密苏里科技大学材料科学与工程系（Department of Materials Science and Engineering, Missouri University of Science and Technology）的Mohamed N. Rahaman教授团队共同完成。其中，赵世昌、李乐（Le Li）和王辉（Hui Wang）为共同第一作者。该研究于2015年发表在生物材料领域权威期刊《Biomaterials》第53卷，页码为379至391，论文于2014年11月26日投稿，2015年2月24日修回，2015年2月27日接收。

二、研究背景与目的

皮肤是人体最大的器官，作为保护屏障在防止感染、水分和电解质流失以及调节体温方面发挥关键作用。大面积全层皮肤缺损的愈合是临床难题之一。目前基于自体移植物、同种异体移植物、异种移植物和生物工程皮肤替代物的治疗方法存在抗原性、疾病传播风险和来源有限等局限。因此，基于生物材料的伤口敷料成为一种具有前景的替代方案。

生物活性玻璃（bioactive glass）长期以来被用于骨再生研究，但近年来的研究表明其具有刺激血管化和愈合软组织伤口的潜力。其中，硼酸盐生物活性玻璃微纤维（borate bioactive glass microfibers）因其高比表面积、快速降解并转化为羟基磷灰石（hydroxyapatite, HA）、易于操作和形状灵活性等优点而受到关注。铜离子（Cu²⁺）作为一种无机血管生成因子，具有成本低、稳定性高和临床安全性较好的特点，能够通过稳定缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α）的表达模拟缺氧状态，从而促进血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）等促血管生成因子的表达。

本研究旨在制备不同含量氧化铜（CuO）掺杂的硼酸盐生物活性玻璃微纤维伤口敷料，系统评价其在体外和体内促进血管生成及愈合全层皮肤缺损的能力，并深入探讨微纤维在软组织伤口愈合中的作用机制。与既往研究相比，本研究重点在两个方面进行了改进：一是研究微纤维可溶性离子产物对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）和成纤维细胞（fibroblasts）的体外反应；二是在啮齿动物模型中系统研究微纤维促进血管化和愈合全层皮肤缺损的能力。

三、研究流程与实验方法

本研究主要包括三个层次的实验流程：材料制备与表征、体外细胞实验和体内动物实验。

1. 材料制备与表征

研究使用的基础玻璃为13-93B3硼酸盐生物活性玻璃，其摩尔组成为6Na₂O、8K₂O、8MgO、22CaO、54B₂O₃和2P₂O₅。该玻璃的组成与硅酸盐13-93生物活性玻璃相同，但将全部SiO₂替换为B₂O₃。通过传统熔融铸造方法制备含0、0.5、1.0和3.0 wt.% CuO的玻璃，分别命名为BG、0.5Cu-BG、1Cu-BG和3Cu-BG。随后将玻璃重新熔化，通过高压气体喷射熔融玻璃并淬灭纤维材料的方法制备微纤维。利用场发射扫描电子显微镜（FESEM）观察微纤维形貌，并通过测量200余根纤维直径确定平均直径。采用X射线衍射（XRD）分析原始微纤维的晶相。

2. 体外降解与转化实验

将各组微纤维以1.0 g/100 mL的比例浸泡于模拟体液（simulated body fluid, SBF）中，在37 °C条件下研究降解和转化为HA的过程。通过电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES）测定不同时间点释放到SBF中的Cu²⁺浓度。同时测定微纤维的重量损失，并利用FESEM、能量色散X射线光谱仪（EDS）和XRD分析反应后微纤维表面HA的形成。

3. 体外细胞实验

由于直接在微纤维上接种细胞存在操作困难，研究采用微纤维离子溶解产物培养基的方法。将微纤维研磨至长度小于38 μm，以100 mg/mL的浓度浸泡于无血清DMEM培养基中24小时，离心收集上清液，过滤后添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素。使用的细胞包括从人脐带静脉分离的HUVECs和原代真皮成纤维细胞。

细胞增殖实验：将HUVECs和成纤维细胞以5×10³细胞/孔的密度接种于96孔板，在不同浓度离子提取物中培养1、3、7天，使用CCK-8试剂盒检测细胞活力。

HUVEC迁移实验：采用Transwell实验，将5×10⁴细胞接种于上室，下室加入含各组微纤维离子溶解产物的培养基，24小时后固定、染色并计数迁移至膜下表面的细胞。

管腔形成实验：将Matrigel基质胶铺于24孔板，上覆3×10⁴ HUVECs细胞悬液，处理12小时后在光学显微镜下计数完整毛细血管数量。

VEGF分泌检测：将10⁵ HUVECs接种于含离子溶解产物的6孔板中培养3天，收集上清液，采用ELISA试剂盒检测VEGF含量。

成纤维细胞血管生成相关基因表达：将成纤维细胞以10⁵细胞/孔接种于6孔板，培养7天和14天后用TRIzol试剂提取RNA，反转录为cDNA后使用qRT-PCR分析VEGF、bFGF和PDGF基因的相对表达量。

4. 体内动物实验

实验选用36只雄性Sprague-Dawley大鼠（2月龄，体重250±12 g）。在每只大鼠背部制备直径为2.0 cm的全层皮肤缺损。根据体外实验结果，选择含3.0 wt.% CuO的3Cu-BG微纤维作为实验组，未掺杂BG微纤维作为阳性对照，未处理缺损作为阴性对照。每个缺损放置200 mg微纤维，并用凡士林纱布加压固定。在术后0、5、10和14天拍摄伤口照片，测量伤口面积并计算伤口闭合百分比。

术后14天，对大鼠进行Microfil灌注，随后使用微计算机断层扫描（micro-CT）对缺损区域进行扫描，重建三维图像并定量分析新生血管面积和数量。

术后7天和14天处死大鼠，取伤口组织进行组织学分析。采用苏木精-伊红（H&E）染色和Masson三色染色观察新生上皮长度和胶原沉积情况。通过CD31免疫组织化学染色和CD31/α-SMA免疫荧光共染色评价新生血管和成熟血管数量。

四、主要研究结果

1. 微纤维表征与体外转化

原始微纤维呈棉絮状外观，SEM观察显示各组微纤维形态无差异，直径范围为0.4–1.2 μm，平均值为0.85 μm。XRD显示原始3Cu-BG微纤维在约30° 2θ处有一个宽峰，表明玻璃为非晶态。浸泡于SBF 7天后，微纤维表面形成颗粒状微结构，EDS分析显示Ca/P原子比从初始的约3.1降至1.59–1.66，接近化学计量HA的1.67，XRD图谱也出现与HA参考谱（JCPDS 72-1243）对应的衍射峰，确认微纤维转化为HA。

转化过程伴随重量损失和离子释放。重量损失在前10天快速增加，之后趋于平稳，最终约达90%，且各组间差异不大。Cu²⁺释放量随初始CuO含量增加而增加，前5天释放较快，随后减慢。20天时0.5Cu-BG、1Cu-BG和3Cu-BG微纤维的Cu²⁺累积释放量分别占初始掺入总量的80.4%、83.4%和88.0%。

2. 体外细胞实验结果

细胞增殖实验显示，第1天各组离子溶解产物对HUVECs和成纤维细胞增殖影响不大；但到第3天和第7天，Cu掺杂微纤维组的细胞增殖显著优于未掺杂组。

Transwell实验表明，Cu掺杂微纤维的离子溶解产物显著促进HUVEC迁移。管腔形成实验中，Cu掺杂组HUVECs在Matrigel上形成拉长的管状结构，而未掺杂组仅形成不完整或稀疏的管状网络。VEGF分泌检测显示，各组微纤维离子溶解产物均能刺激HUVECs分泌VEGF，但Cu掺杂组显著高于未掺杂组。

qRT-PCR结果显示，成纤维细胞中VEGF、bFGF和PDGF基因的表达水平随微纤维CuO含量增加而升高，且Cu掺杂组在7天和14天两个时间点的表达量均显著高于未掺杂组。

3. 体内创面愈合结果

术后所有动物均无不良反应。伤口面积随时间缩小，BG和3Cu-BG组伤口缩小速度快于未处理组。第14天时BG和3Cu-BG组伤口几乎闭合，而未处理组未完全闭合。定量分析显示3Cu-BG组在术后5、10和14天的伤口闭合率均显著优于未处理组；BG组在10天和14天显著优于未处理组。3Cu-BG组伤口闭合虽优于BG组，但第14天差异不显著。

4. Micro-CT评价血管形成

术后14天micro-CT三维重建图像显示，3Cu-BG处理组的血管密度明显高于BG组和未处理组。定量分析表明3Cu-BG组的血管面积和血管数量显著高于其余两组。

5. 组织学与免疫学分析

H&E染色显示，第7天时3Cu-BG组新生上皮长度显著大于BG组和未处理组；第14天时仍显著大于未处理组，但与BG组差异不显著。Masson三色染色显示，与未处理组相比，BG组胶原沉积广泛，纤维粗大呈波浪状；3Cu-BG组胶原纤维更多且排列有序，与正常皮肤相似。BG和3Cu-BG组中类毛囊和皮脂腺结构多于未处理组。

免疫组织化学和免疫荧光染色显示，新生血管数量从第7天到第14天增加。第14天时3Cu-BG组的CD31阳性血管密度和成熟血管数量均显著高于BG组和未处理组。

五、结论与研究意义

本研究证明Cu掺杂硼酸盐生物活性玻璃微纤维在体外能快速降解转化为HA，并释放Ca、B和Cu离子。其离子溶解产物对HUVECs和成纤维细胞无毒性，并能显著促进HUVEC迁移、管腔形成和VEGF分泌，同时上调成纤维细胞血管生成相关基因的表达。在体内大鼠全层皮肤缺损模型中，3.0 wt.% CuO掺杂的微纤维相比未掺杂微纤维和未处理组表现出显著更强的促进血管生成能力和创面愈合效果。

本研究的科学价值在于系统阐明了硼酸盐生物活性玻璃微纤维促进软组织创面愈合的细胞和分子机制，证实Cu²⁺离子在该过程中发挥关键作用。在应用价值方面，Cu掺杂硼酸盐生物活性玻璃微纤维具有棉絮状外观，便于覆盖创面、吸收渗出液、防止创面干燥并允许氧气透过，且可在创面愈合后完全降解清除，因此有望成为一种理想的新型创面敷料，尤其适用于需要促进血管化的慢性创面和糖尿病创面。

六、研究亮点

本研究的突出发现包括：（1）Cu掺杂微纤维的离子溶解产物在体外可直接促进HUVEC迁移、管腔形成和VEGF分泌，这为理解材料促进血管化的机制提供了直接证据；（2）3Cu-BG微纤维在体内不仅能增加新生血管数量，还能提高成熟血管比例，这对于形成功能性血管网络至关重要；（3）3Cu-BG微纤维促进创面愈合主要通过新生上皮化而非创面收缩，这有利于减少瘢痕形成。

在方法上，本研究将材料降解转化实验、体外细胞功能实验和体内多模态血管评价（micro-CT、免疫组化、免疫荧光）相结合，形成了从材料特征到细胞响应再到组织再生的完整证据链。此外，研究采用微纤维离子溶解产物代替直接细胞接种的方式评价材料生物活性，避免了微纤维结构对实验操作的干扰，这一方法学选择具有实用性。