研究报告：《脊椎动物病毒RNA元件的功能图谱：稳定RNA并增强翻译》

一、主要作者、机构与发表信息

本研究由 Jenny J. Seo、Chemin Lee、Dongbin Lim、Minseok Jeong、Soo-Jin Jung 和 V. Narry Kim 等人完成。其中 Jenny J. Seo 和 Chemin Lee 为共同第一作者，V. Narry Kim 为通讯作者。研究团队来自韩国基础科学研究院（Institute for Basic Science）RNA 研究中心、首尔国立大学（Seoul National University）生物科学学院以及西江大学（Sogang University）生命科学系。该论文发表于 Cell 杂志第 189 卷，于 2026 年 10 月 29 日在线发表。

二、学术背景与研究目的

病毒在长期进化中形成了紧凑且高效的调控元件，尤其是 RNA 上的顺式作用元件（cis-acting RNA elements），能够招募宿主因子以控制 RNA 稳定性和翻译效率，从而增强病毒复制与适应性。然而，尽管宏基因组测序已大幅扩展了病毒序列空间，这些序列中蕴含的调控元件及其作用机制仍大多未被实验解析。此前已知 TENT4（terminal nucleotidyltransferase 4）家族通过“混合加尾”（mixed tailing）机制参与多种病毒 mRNA 的稳定化，但其在病毒界的分布广度、结构多样性以及是否存在 TENT4 非依赖的替代机制仍不清楚。本研究旨在构建一个覆盖广泛脊椎动物病毒的 RNA 调控元件功能图谱，系统鉴定增强 RNA 稳定性和翻译效率的病毒元件，并深入解析其作用机制。

三、研究流程与实验设计

本研究采用了一套多层级的筛选与验证流程。

第一步，构建病毒基因组片段文库。研究团队从 37 个病毒科中筛选出 337 种代表物种，覆盖 297 个属。与先前研究相比，属级别的系统发育广度扩大了 3 倍以上。他们设计了 197 nt 长度的瓦片式寡核苷酸（tiling oligonucleotides），步长 20 nt，共产生 196,277 个片段，分为两个文库：VL1 含有 99,922 个片段，来源于单链 RNA 病毒；VL2 含有 96,438 个片段，来源于 DNA 病毒、双链 RNA 病毒和逆转录病毒等。每个文库包含已知阳性对照（如 Saffold 病毒的 K4 和 Aichi 病毒的 K5）、失活突变体以及阴性对照。

第二步，进行大规模平行报告分析（MPRA）。病毒片段被插入到 EGFP 报告基因的 3′ UTR 中，转染 HCT116 细胞后，通过测序计算 RNA 丰度评分（log2 RNA/DNA 比值），并利用蔗糖梯度沉降结合测序评估翻译效率。此外，研究团队开发了基于单拷贝基因组整合的报告系统：将报告基因盒整合到 HEK293T 重组细胞系的特定位点，通过流式细胞分选（FACS）分离 GFP 高表达细胞进行测序，以消除位置效应。总体上，RNA 丰度与翻译效率之间相关性较差，表明这两个过程在很大程度上是解偶联的。最终鉴定出 330 个增强蛋白输出超过 10 倍的片段。

第三步，筛选 TENT4 依赖性元件。利用 TENT4 抑制剂 RG7834 及其非活性异构体 RO0321，结合单拷贝整合筛选系统，将 GFP 表达评分对药物敏感性进行分层分析。共鉴定出 85 个 TENT4 依赖性瓦片，聚类为 23 个基因组位点。其中 53 个瓦片（对应 16 个位点）含有 CNGG 环基序。研究团队进一步将 TENT4 依赖性元件划分为六个亚型：I 型含 CNGG 基序且依赖 ZCCHC14 辅因子，II 型依赖 ZCCHC2，III 型以 CR1 为代表使用未知接头蛋白，IV 型以 GL1 为代表形成 H 型假结结构，V 型以 MG1 为代表含 AGACCY 和 GGGGNARU 基序，VI 型以 PS1 和 SC1 为代表特征尚不明确。

第四步，鉴定 TENT4 非依赖元件并解析 PT1 机制。在 RG7834 处理下仍保持活性的候选元件中，PT1 是三个筛选实验中均表现最强的元件之一。PT1 来自鳗鱼小核糖核酸病毒（eel picornavirus 1，属于 Potamipivirus 属），其最小功能区域为 79 nt，折叠为一个带有顶端环和多个内部环的发夹结构。在体外转录 mRNA 中，PT1 将 mRNA 半衰期从 7.6 小时延长至 23.1 小时，与环状 RNA 的 24.9 小时无显著差异。高分辨率 poly(A) 尾分析（HIRE-PAT）显示，PT1 的 poly(A) 尾从初始 60 nt 延长至中位数 194 nt，表明其促进胞质 poly(A) 尾延伸。

第五步，鉴定 PT1 的结合因子。研究团队开发了“腺苷酸化 RNA 拉下实验”（ARPA）方法：使用带有 30 nt 腺苷酸尾的 RNA 探针固定在 oligo(dT) 磁珠上，结合 TMT 标记质谱分析。结果显示，PT1 的直接结合蛋白是经典核 poly(A) 聚合酶 PAPγ（PAPOLG）和 PAPα（PAPOLA），而非此前认为仅限于核内转录偶联 pre-mRNA 加工的酶。通过 siRNA 敲低和 PAPγ 敲除细胞验证，PT1 驱动的 poly(A) 尾延伸和蛋白表达均显著下降。亚细胞组分分析显示 PAPγ/α 在细胞质中也存在。体外重组蛋白实验证明，PAPγ/α 可直接结合 PT1 RNA 并在无 CPSF 复合物的情况下催化序列特异性 poly(A) 尾延伸。

四、主要结果

本研究在多个层面产生了系统性结果。

在筛选层面，阳性元件广泛分布于多个病毒科，同一属内序列保守，但 RNA 丰度与翻译效率之间的弱相关性说明多数元件主要通过单一机制发挥作用，而最强的蛋白输出增强元件则同时提升两者。这一发现为后续分类提供了基本框架。

在 TENT4 依赖组中，CNGG 基序元件分布最广，跨越六个远缘病毒科，表明这一简单基序在病毒中易于趋同演化。深度突变扫描显示，CNGG 环中的关键核苷酸不可替代，但第五位核苷酸可被替换或删除。HR1 和 AH1 的结构分析显示，CNGG 基序可以位于顶端环或内部环，均能有效招募 ZCCHC14-TENT4 复合物。非 CNGG 依赖的 TENT4 元件则通过不同结构执行功能：GL1 通过 H 型假结中环与下游单链区的碱基配对起作用，补偿突变可恢复活性；MG1 依赖单链区的 AGACCY 基序和环部的 GGGGNARU 基序。这些结果表明，TENT4 通过至少六种不同的接头蛋白识别不同 RNA 底物，构成多功能调控网络。

在 TENT4 非依赖组中，PT1 是最具突破性的发现。PT1 的最小功能区域通过深度突变扫描精确定位，其底部茎区的碱基配对重要性优先于序列保守性，而顶端 GUURUG 环和两个内部环则需要特定序列。PT1 在多种细胞类型中均高效发挥作用，且其稳定性增强效果在细胞周期 G1/S 阻滞后依然存在，表明细胞质 PAP 群体在核膜未破裂时已足够功能。值得注意的是，文库级别的 PAP 依赖性筛选显示，大多数序列在 PAPα/γ 缺失后 mRNA 稳定性仅轻微下降，但 PT1 所在瓦片下降最显著，另有 OS2（Oscivirus）和 JL1（Jeilongvirus）等元件也显示出部分 PAP 依赖性，提示这一机制在病毒界中可能更为广泛。

五、结论与意义

本研究构建了迄今覆盖范围最广的脊椎动物病毒 RNA 调控元件功能图谱。研究团队将这些通过促进 poly(A) 尾延伸稳定 mRNA 的元件统称为“tailons”（尾子），至少鉴定出 23 个 TENT4 依赖性 tailons 和 1 个 PAP 依赖性 tailon。TENT4 tailons 的多样性揭示混合加尾路径的生物学通用性和适配灵活性。PT1 的发现打破了 PAPγ/α 仅参与核内全局性 pre-mRNA poly(A) 加工的经典认知，确立了一种新的胞质、基因特异性、不依赖 CPSF 复合物的 poly(A) 尾延伸模式。

从科学价值角度看，该研究不仅扩展了 poly(A) 尾生物学的范畴，还确立了病毒组作为发现宿主 RNA 调控机制的重要资源。从应用价值看，PT1 赋予线性 mRNA 近似环状 RNA 的稳定性，而无需复杂环化工艺，在 mRNA 疫苗、基因替代治疗和 RNA 器件设计中具有直接应用前景。此外，该研究的高通量平台和 ARPA-MS 方法为发现其他 RNA 调控元件及其作用因子提供了可扩展的技术框架。

六、研究亮点

本研究的主要亮点包括：第一，构建了覆盖 297 个病毒属、约 20 万个基因组片段的功能图谱，规模和广度均为迄今之最；第二，发现了至少六种不同结构类型的 TENT4 依赖性元件，证明病毒通过趋同进化多次利用同一宿主通路；第三，揭示了 PT1 直接招募经典 PAPγ/α 进行胞质 poly(A) 尾延伸的全新机制，挑战了 PAP 蛋白核定位的既有教条；第四，将 PT1 的线性 mRNA 稳定性提升至与环状 RNA 相当的水平，为 RNA 治疗提供了更易制造的替代方案；第五，ARPA-MS 方法作为自研实验技术，为 RNA-蛋白互作研究提供了有效工具。此外，该研究还鉴定了多个既不依赖 TENT4 也不依赖 PAP 的候选元件，如黄病毒 3′ UTR 的哑铃结构元件 FL1，为未来研究留下了广阔空间。