受体转运蛋白4介导对小鼠细胞中丙型肝炎病毒复制的抑制
一、研究团队与发表信息
本研究由Michael P. Schwoerer、Sebastian Carver、Aaron E. Lin、Jianche Liu、Thomas R. Cafiero、Keith A. Berggren等共同完成，通讯作者为Alexander Ploss。研究团队主要来自普林斯顿大学分子生物学系，其他合作者分别来自浙江大学-爱丁堡大学联合学院、波士顿大学国家新发传染病实验室等多个机构。该研究于2025年9月8日以开放获取的形式发表在学术期刊《PLOS Pathogens》上，文章标题为“Receptor transporter protein 4 (RTP4)-mediated repression of hepatitis C virus replication in mouse cells”。
二、学术背景与研究目的
本研究属于病毒学与宿主-病原体相互作用的交叉领域，聚焦于丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus, HCV）的物种嗜性限制机制。HCV是一种主要感染人类和黑猩猩肝细胞的正链RNA病毒，可导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌。尽管已有直接作用抗病毒药物可有效治愈感染，但由于缺乏能够完全模拟人类感染全过程的小型动物模型，HCV疫苗研发、共感染研究以及长期免疫反应探索等关键科学问题面临巨大阻碍。小鼠因其遗传工具丰富、繁殖饲养体系成熟，是理想的小型动物模型候选。然而，HCV在小鼠肝细胞中的复制受到严格限制，这被认为是多种宿主因子不相容性和宿主限制因子共同作用的结果。
先前的研究发现，黑狐蝠的受体转运蛋白4（Receptor transporter protein 4, RTP4）是一种干扰素（Interferon, IFN）诱导的、能有效抑制多种在内质网复制的RNA病毒的广谱抗病毒蛋白。值得注意的是，在对多种物种的RTP4直系同源物进行分析时，发现小鼠RTP4（mmRTP4）对HCV表现出强烈的抗病毒效应，而人源RTP4（hsRTP4）的作用则相对微弱。然而，mmRTP4抑制HCV感染的具体分子机制尚不明确。
因此，本研究旨在深入探究RTP4在HCV物种特异性限制中的作用。具体目标包括：1）确认并比较mmRTP4与hsRTP4对HCV感染的抑制效果及其特性；2）通过构建种间嵌合体蛋白，鉴定介导抑制功能的关键结构域；3）探究mmRTP4是否能够抑制已建立的HCV感染；4）通过转录组学和蛋白质相互作用分析，阐明其抑制机制是否涉及干扰素刺激基因（Interferon-stimulated genes, ISGs）的诱导或与病毒复制机器的直接作用；5）最后，在体内评估敲除RTP4是否能够增加对HCV易感小鼠模型的病毒容许性。
三、详细研究流程与方法
本研究包含体外和体内两大部分，涉及分子生物学、细胞生物学、病毒学、转录组学和动物模型等多种技术手段。
第一环节：体外验证RTP4对HCV的物种特异性抑制作用 研究首先在体外建立了评估体系。将编码hsRTP4或mmRTP4的基因克隆到共表达荧光蛋白ZsGreen或DsRed2的双顺反子慢病毒载体中。用这些慢病毒分别或共同转导人肝癌细胞系Huh7，建立稳定表达不同RTP4的细胞系。三天后，用HCV J6/JFH1 (JC1)毒株以感染复数（MOI）为0.1感染这些细胞。感染后第四天，通过流式细胞术检测细胞内HCV非结构蛋白5A（NS5A）的表达，以此量化病毒感染水平。通过比较单独表达hsRTP4、mmRTP4或两者共表达的细胞中NS5A阳性细胞的频率，评估其抗病毒效果及 dominance 效应。
第二环节：鉴定RTP4抑制HCV的关键结构域 为了确定mmRTP4强效抑制HCV的关键区域，研究团队进行了结构域映射分析。RTP4蛋白包含三个结构域：锌指结构域（Zinc-finger domain, ZFD）、无序可变区（Disordered variable region, DVR）和跨膜结构域（Transmembrane domain, TM）。研究人员利用AlphaFold 3软件预测了人和小鼠RTP4及其嵌合体的三级结构，并通过UCSF ChimeraX的Matchmaker插件进行结构相似性定量比较。 基于结构信息，他们通过分子克隆构建了一系列人-鼠嵌合体RTP4：交换DVR区（mmRTP4-hsDVR和hsRTP4-mmDVR）。更进一步，他们将ZFD细分为三个亚区（分别大致对应三个CXXC基序），并将这些亚区替换到对应物种的RTP4背景上，构建了mmRTP4-hsZFD[1-3]和hsRTP4-mmZFD[1-3]共六种嵌合体。将这些嵌合体构建到慢病毒载体中，按照第一环节的流程转导Huh7细胞并感染HCV，通过流式细胞术分析NS5A阳性率，从而鉴定出对抑制功能至关重要的最小结构单元。
第三环节：探究mmRTP4对已建立HCV感染的抑制作用 为了区分RTP4是阻断病毒入侵还是抑制病毒复制，研究团队设计了一个“治疗性”实验。先用HCV (MOI=1)感染Huh7-Lunet细胞一周，使超过90%的细胞成为NS5A阳性，建立起稳定的感染。然后，用表达hsRTP4、mmRTP4或空白对照（均共表达荧光蛋白）的慢病毒转导这些已被感染的细胞。在转导后的不同时间点（3, 6, 9天），通过流式细胞术分别分析转导成功（荧光阳性）和未转导（荧光阴性）的“旁观者”细胞中的NS5A阳性率变化。此外，在转导后第9天，收集细胞培养上清和细胞裂解物，通过有限稀释法（TCID50）滴定其中感染性病毒颗粒的滴度，以评估mmRTP4对病毒产生和释放的影响。
第四环节：转录组学分析RTP4的抑制机制 为了探究mmRTP4的抑制作用是否通过诱导ISG反应（即细胞非自主性效应）来介导，研究团队对上述“治疗性”实验的样本进行了批量RNA测序（bulk RNA-seq）。他们在慢病毒转导后12、24和48小时，分别收集了被HCV感染并转导了mmRTP4、hsRTP4或空白对照的Huh7-Lunet细胞，以及未感染对照组的细胞（72小时）。提取总RNA进行建库测序。使用STAR将 reads 比对到人类基因组（hg38）和HCV/JC1参考序列，用HTSeq-count统计唯一映射 reads。利用DESeq2软件包进行差异表达基因分析，比较转导组与mock对照组在HCV感染背景下的基因表达谱变化，重点关注ISG或其他已知抗病毒因子的表达情况。
第五环节：探究RTP4与HCV复制机器的直接相互作用 鉴于转录组数据未显示明显的ISG诱导，研究团队推测mmRTP4可能直接靶向HCV复制复合体。他们在RTP4的N端添加了FLAG标签，构建了FLAG-hsRTP4和FLAG-mmRTP4表达载体，并验证了标签化蛋白的表达、定位和抗病毒活性均与未标签蛋白一致。 为了在感染背景下检测低丰度的RTP4与HCV NS5A蛋白之间的相互作用，研究采用了高灵敏度的原位邻近连接 assay（Proximity Ligation Assay, PLA）。将Huh7-Lunet细胞先感染HCV，再转导FLAG标签的RTP4慢病毒。48小时后固定细胞，使用针对FLAG标签和HCV NS5A的一抗进行孵育，随后使用带有特定寡核苷酸的PLA二抗。当两个靶蛋白足够接近时（<40 nm），二抗上的寡核苷酸可进行连接、环化并滚环扩增，产生荧光信号点。通过共聚焦显微镜成像，并使用Python OpenCV库自动量化每个细胞内的荧光信号点数量，从而定量比较hsRTP4和mmRTP4与NS5A相互作用的强度。
第六环节：体内评估RTP4敲除对HCV感染的影响 为了在整体动物水平评估RTP4的限制作用，研究团队构建了基因工程小鼠模型。他们将一个先前建立的、表达人源化HCV入侵因子（CD81和Occludin，使其支持病毒进入）的小鼠品系（cd81el2[h/h] oclnel2[h/h]），与一个现有的RTP4基因敲除小鼠品系（rtp4−/−）进行杂交，最终获得了cd81el2[h/h] oclnel2[h/h] rtp4−/−小鼠（三基因人源化敲除鼠）及其对照（cd81el2[h/h] oclnel2[h/h]）。 两组小鼠通过尾静脉接种1×10^6 TCID50的HCV JC1病毒。在接种后21天内，定期采集血清，通过一步法RT-qPCR定量血清中的HCV RNA水平（病毒血症）。在实验终点（21天），处死小鼠并采集肝脏组织，同样通过RT-qPCR检测肝脏中的HCV RNA载量。
第七环节：在免疫缺陷背景下评估RTP4敲除的影响 考虑到小鼠的适应性免疫可能清除低水平复制的病毒，研究团队进一步在完全免疫缺陷的背景下进行了评估。他们使用了FAH−/− NOD Rag1−/− IL2Rγnull (FNRG)小鼠，这是一种肝损伤免疫缺陷模型，可用于移植异种肝细胞。从cd81el2[h/h] oclnel2[h/h] rtp4−/−供体小鼠分离原代肝细胞，通过脾内注射移植到FNRG受体小鼠体内。通过撤除和给予保护性药物NTBC进行选择性压力，促进供体肝细胞在受体肝脏中增殖嵌合。在确认成功嵌合（通过FAH免疫组化染色）后，给这些嵌合小鼠（FNRG[cd81el2[h/h] oclnel2[h/h] rtp4−/−]）静脉接种HCV，并长期监测血清和肝脏中的病毒RNA水平。作为阳性对照，研究还使用了移植了原代人肝细胞的FNRG小鼠，并证实其能够建立持续的HCV感染。
四、主要研究结果
1. mmRTP4是HCV感染的显性体外抑制剂 流式细胞术结果显示，表达hsRTP4的Huh7细胞与未转导对照细胞相比，HCV NS5A阳性率无显著差异。相反，表达mmRTP4的细胞中几乎完全检测不到NS5A阳性信号，表明mmRTP4能强效抑制HCV复制。当细胞同时表达hsRTP4和mmRTP4时，其抑制表型与单独表达mmRTP4时相同，证明mmRTP4的抑制作用是显性的，能覆盖hsRTP4的微弱表型。
2. RTP4的ZFD是决定物种特异性HCV抑制的关键结构域 结构预测显示人和小鼠RTP4整体结构相似。功能实验发现，将mmRTP4的DVR替换为人源DVR（mmRTP4-hsDVR）后，其仍保留显著的抗病毒活性，尽管抑制效率略低于全长mmRTP4，这提示小鼠DVR-TM区域对抗病毒功能有辅助作用。而将hsRTP4的DVR替换为鼠源（hsRTP4-mmDVR）则不能赋予其抑制能力。这首次将抗病毒功能定位于ZFD。进一步的亚区替换实验表明，将hsRTP4的三个ZFD亚区逐一替换为鼠源，均不能使hsRTP4获得抑制能力，说明完整的mmRTP4 ZFD是必需的。另一方面，将mmRTP4的ZFD第一个亚区（N端部分）替换为人源（mmRTP4-hsZFD_1）仍能完全抑制HCV，而替换第二或第三个亚区则会导致抑制能力大幅减弱。这表明mmRTP4 ZFD中决定物种特异性的关键区域并不在N端，而在更靠C端的部分。
3. mmRTP4能够消除已建立的HCV感染 在“治疗性”实验中，转导mmRTP4后，表达mmRTP4的细胞（荧光阳性）其NS5A阳性率随时间推移持续下降，到第9天几乎清零。而转导hsRTP4或空白对照的细胞，其感染率保持稳定。有趣的是，在同一培养皿中未转导mmRTP4的“旁观者”细胞，其NS5A阳性率也出现了缓慢但显著的下降。病毒滴定结果显示，mmRTP4表达细胞的细胞内病毒滴度显著降低，但细胞外上清中的病毒滴度与对照组无统计学差异，提示mmRTP4可能轻微影响感染性病毒粒子的产生，但主要作用是抑制细胞内复制。
4. mmRTP4的转导诱导独特且短暂的转录反应，不依赖于ISG RNA-seq分析显示，在HCV感染背景下转导mmRTP4后12小时，出现了一组特异性上调的差异表达基因，而转导hsRTP4则无此现象。然而，这组上调基因中并未包含任何经典的ISG（如MX1、OAS1、ISG15等）或已知能抑制黄病毒科感染的因子。到转导后24和48小时，这种差异表达模式基本消失。这一结果与“旁观者”细胞感染率缓慢下降的现象结合，排除了mmRTP4通过快速、强烈诱导ISG（从而产生旁分泌效应）来抑制HCV的可能性。抑制作用的长期持续更可能归因于mmRTP4蛋白本身的直接作用。
5. mmRTP4与HCV NS5A的相互作用强于hsRTP4 PLA实验证实，在HCV感染细胞中，FLAG-mmRTP4和FLAG-hsRTP4均能与HCV NS5A蛋白发生相互作用，产生特异性的荧光信号点。定量分析显示，mmRTP4与NS5A的相互作用信号强度大约是hsRTP4的两倍。这为mmRTP4更强的抗病毒表型提供了直接的分子互作证据，表明其可能通过更有效地结合并干扰HCV复制复合体的关键组件NS5A来发挥功能。
6. 体内敲除RTP4不足以使小鼠对HCV易感 在免疫健全的cd81el2[h/h] oclnel2[h/h] rtp4−/−小鼠中，静脉接种HCV后，血清中可立即检测到病毒RNA（来自接种的病毒颗粒），但在长达21天的观察期内，病毒RNA水平没有出现上升趋势，始终维持在接种后的基线水平，与对照组（仅人源化入侵因子）无差异。终期肝脏组织的病毒RNA检测结果亦然。 在免疫缺陷的FNRG小鼠中，即使其肝脏被对HCV易感且缺失RTP4的小鼠肝细胞成功嵌合，接种HCV后同样未观察到病毒血症的上升或肝脏病毒载量的增加。而作为阳性对照的、移植了人肝细胞的FNRG小鼠则建立了典型的持续性HCV感染。这些体内实验明确证明，仅敲除RTP4这一限制因子，即使在小鼠细胞已支持病毒进入且缺乏免疫清除的条件下，仍不足以克服HCV在小鼠细胞中复制所面临的其他障碍。
五、研究结论与意义
本研究系统阐明了RTP4在限制HCV跨物种感染中的关键作用及其分子机制。主要结论如下： 1. mmRTP4是HCV复制的强效、显性抑制剂，而hsRTP4作用微弱，这构成了HCV物种嗜性的一个潜在限制层。 2. 抑制功能的关键决定域位于mmRTP4的锌指结构域（ZFD），其C端区域对物种特异性至关重要，而DVR-TM区域起辅助作用。 3. mmRTP4能够直接靶向并瓦解已建立的HCV感染，主要作用于病毒复制阶段，其机制不依赖于诱导干扰素刺激基因（ISG）。 4. mmRTP4通过更强烈地与HCV NS5A蛋白相互作用来发挥抑制作用，这可能是其物种特异性抗病毒活性的结构基础。 5. 然而，RTP4并非小鼠抵抗HCV感染的唯一屏障。单独敲除RTP4，即使在病毒进入障碍被克服、免疫系统缺失的情况下，也无法使小鼠支持HCV的复制。这表明在复制和组装环节，还存在其他重要的物种不相容性因子（如TRIM26、亲环蛋白A等）共同阻止了HCV的生命周期。
本研究的科学价值在于：深化了对HCV窄宿主嗜性分子机制的理解，首次详细解析了RTP4这一ISG家族成员在限制HCV感染中的物种特异性功能、关键结构域和作用模式（直接靶向NS5A）。它揭示了宿主抗病毒防御中，存在一种不依赖典型ISG信号放大的、由单个ISG效应蛋白直接执行的长效抑制机制。应用价值方面，该研究为未来开发更完善的HCV小鼠模型提供了关键信息：要构建支持HCV复制的免疫健全小鼠模型，除了解决病毒进入问题外，可能需要同时操控包括RTP4在内的多个内在限制因子和宿主因子相容性。研究指出，构建表达人源RTP4替代鼠源RTP4的小鼠，或联合干预其他已识别的限制点，可能是未来的方向。
六、研究亮点
七、其他有价值的观点
研究在讨论部分提出了一个三层范式来解释小鼠