本研究由四川大学国家生物材料工程技术研究中心及生物医学工程学院的赵明达、徐瑞灵、杨月迪、童磊、梁洁、蒋庆、樊渝江、张兴栋、孙勇等作者完成，其中赵明达与徐瑞灵为共同第一作者，孙勇为通讯作者。该研究成果于2023年3月8日在线发表于Journal of Controlled Release第356卷，页码为219至231。
本研究属于生物材料与肿瘤术后辅助治疗领域，主要针对黑色素瘤术后复发问题。手术是实体瘤最有效的治疗手段，但术后残留的微小肿瘤组织或散在肿瘤细胞是导致肿瘤转移与复发的主要原因。传统化疗作为术后辅助治疗虽然能杀伤残余肿瘤，但因药物非特异性分布，疏水性化疗药物对正常组织与器官毒性较大。智能响应纳米载体虽能改善药物溶解性与体内分布，但经静脉给药后药物-loaded纳米胶束（nano-micelle）在肿瘤部位的生物利用度仍较低。局部化疗可将药物富集于病灶并直接作用于残余肿瘤组织与细胞，减少化疗药物全身循环带来的副作用。因此，本研究旨在构建一种可生物吸收的纳米胶束杂化水凝胶支架（bioabsorbable nano-micelle hybridized hydrogel scaffold, HGMP），通过局部持续释放靶向纳米胶束来清除术后残留肿瘤细胞，抑制黑色素瘤术后复发。
研究流程可分为五个主要部分。第一部分是组织亲和性杂化交联水凝胶支架的制备与优化。首先通过酰胺化反应分别合成巯基明胶（mercapto gelatin, GelS）和多巴胺修饰透明质酸（dopamine-modified hyaluronic acid, HAD），利用核磁共振氢谱和紫外光谱确认其化学结构，多巴胺接枝率约为7.4%，巯基接枝率为4.409±0.530 μg/mg。将GelS与HAD按不同比例（HAD:GelS=1:0、2:1、1:1、1:2）在中性条件下混合，通过巯基自交联、巯基-多巴胺点击反应和醌-氨基席夫碱反应快速形成水凝胶，冻干后得到不同比例的杂化交联水凝胶支架，分别标记为HAD、H2G1、H1G1、H1G2。通过X射线光电子能谱和傅里叶变换红外光谱表征了水凝胶的化学结构，醌与氨基形成亚胺键、醌与巯基反应后被还原为羟基，证实了凝胶化机制。力学测试表明，随GelS比例增加，储能模量升高、损耗模量降低，吸水率下降。细胞相容性实验中，NIH/3T3细胞在H1G1支架表面第1天开始铺展，第5天增殖最佳，因此选择H1G1（标记为HG）作为最优支架。B16F10黑色素瘤细胞在HG表面也快速增殖并聚集，表明HG对正常细胞和肿瘤细胞均具有良好的亲和性。
第二部分是还原响应性纳米胶束的构建及HGMP的制备。通过迈克尔加成反应合成聚酰胺胺-聚乙二醇两亲性聚合物（PAA-PEG-Mal及对照PAA-PEG），包载疏水性阿霉素（doxorubicin, DOX）自组装形成还原响应性载药纳米胶束（PP/DOX），粒径约21.47 nm，表面电位约-4.28 mV，载药量约13.6%。在高浓度还原型谷胱甘肽（GSH）条件下，DOX可从PP/DOX中快速释放。将带有马来酰亚胺基团的PP/DOX通过巯基-马来酰亚胺点击反应整合到HG中，冻干后获得HGMP。对照组包括直接装载游离DOX的HGD和混合无马来酰亚胺基团PP/DOX的HGP。扫描电镜显示DOX在HGD和HGP中分散不均匀，而HGMP孔隙率最高。在含胶原酶和透明质酸酶的缓冲液中，HGMP随降解逐渐释放PP/DOX，释放出的纳米胶束粒径增大至47.77 nm，表面电位变为-3.21 mV，表明纳米胶束表面修饰了明胶降解片段，形成靶向PP/DOX。
第三部分是体内外靶向性能评价。流式细胞术结果显示，HGMP降解释放的靶向PP/DOX在B16F10细胞内的蓄积显著高于普通PP/DOX，而在NIH/3T3和L929正常细胞中靶向性较弱。共聚焦显微镜及三维重建证实靶向PP/DOX主要分布于细胞质，部分与细胞核重叠。利用透明质酸、明胶及三种RGD肽进行靶点屏蔽实验，发现明胶和RGD肽均可阻断纳米胶束进入细胞，证明明胶片段中的RGD序列通过与肿瘤细胞表面高表达的整合素结合介导了靶向作用。在体实验中，将HGP和HGMP植入B16F10-luci皮下瘤小鼠瘤旁，三天后活体成像及肿瘤冰冻切片显示HGMP组肿瘤内DOX荧光强度显著高于HGP组，表明HGMP释放的纳米胶束在体内具有肿瘤靶向与渗透能力。
第四部分是体外抗肿瘤能力评价。IC50测定显示PP/DOX显著降低了对L929和NIH/3T3细胞的毒性，IC50值较游离DOX显著升高（p<0.00001）。在B16F10细胞二维培养中，HGD、HGP和HGMP均能长期抑制细胞增殖。第8天FDA/PI和鬼笔环肽染色显示，HGD和HGP表面B16F10细胞成簇聚集，而HGMP表面细胞稀疏分散，三维重建及荧光定量进一步证实HGMP能抑制肿瘤细胞聚集，细胞簇内细胞数不超过4个。
第五部分是体内抗肿瘤效果与安全性评价。在散在肿瘤细胞模型中，将B16F10细胞悬液注入小鼠皮下切口后分别植入不同支架。21天后，HG组因支架孔隙吸收大量肿瘤细胞形成较大肿瘤，而HGD、HGP和HGMP均能有效抑制肿瘤发生。HGMP组小鼠皮肤脱毛面积和灰值显著小于HGD组，皮肤H&E染色显示HGD组毛囊严重受损，而HGMP组毛囊相对完整。在术后黑色素瘤模型中，切除约200 mm³肿瘤后保留直径约2 mm的残余肿瘤组织，再植入支架。21天后，HGMP组肿瘤复发率仅为20%，显著低于对照组和HG组，且复发肿瘤体积与重量均最小。免疫组化显示HGMP组Ki-67和GPNMB表达均处于低水平，表明HGMP有效抑制了肿瘤增殖与侵袭。血液生化指标及主要器官H&E染色未见明显损伤，说明HGMP降低了游离DOX的局部毒性和全身毒性。
本研究的结论是：通过GelS与HAD的多重化学反应构建的组织亲和性杂化水凝胶支架HG，可通过巯基-马来酰亚胺点击反应整合PP/DOX形成HGMP。HGMP在酶降解条件下长效释放靶向载药纳米胶束，通过明胶降解片段中的RGD序列靶向肿瘤细胞表面整合素，显著增加细胞内药物蓄积，在体外长期抑制B16F10细胞增殖与聚集，在体内吸附散在肿瘤细胞并抑制其成瘤，降低术后黑色素瘤复发率，同时减轻游离DOX对毛囊组织的损伤。该策略为肿瘤术后辅助治疗提供了一种有价值的方案。
本研究的亮点在于：一是利用明胶降解片段作为天然靶向分子，赋予载药纳米胶束肿瘤靶向性，无需额外合成靶向配体；二是通过点击反应将纳米胶束共价整合到水凝胶网络中，实现了纳米胶束的均匀分散和随水凝胶降解释放的长期持续药物输送；三是系统评价了HGMP在散在肿瘤细胞模型和术后复发模型中的双重作用，即物理吸附散在肿瘤细胞和化学杀伤残余肿瘤，为术后局部化疗提供了新的思路。