冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术近年来在结构生物学领域取得了革命性进展，使研究者能够在近原生状态下解析生物大分子复合物的高分辨率结构，并能够在细胞内原位观察亚细胞结构。然而，高质量的玻璃化样品制备仍然是制约该技术广泛应用的主要瓶颈。对于单颗粒分析（SPA）而言，需要在载网上形成厚度小于50纳米的玻璃态冰膜，同时保持大分子完整性和合适的颗粒分布；对于冷冻电子断层扫描（cryo-ET）而言，则需要完整地玻璃化较厚的哺乳动物细胞样品。传统的手工或半自动制样方法存在重复性差、通量低、冰层厚度难以精确控制等问题，且缺乏制样后即时质量评估的手段。
针对上述挑战，来自欧洲分子生物学实验室（EMBL）多个研究单位的研究团队在Gergely Papp和Florent Cipriani等人的带领下，开发了一台名为EasyGrid的全自动模块化冷冻电镜样品制备平台。该研究成果于2026年6月23日在线发表在*Nature Methods*期刊上。EasyGrid集成了在线等离子体处理、微流体点样、无印迹样品铺展、射流玻璃化以及基于光干涉法的载网质量控制等关键技术，旨在实现从样品加载到质量评估的全流程自动化和标准化。
EasyGrid是一台独立的台式设备，由多个功能模块组成，通过自动化机械臂系统在各模块之间传输载网。整个平台可划分为七个核心模块：载网加载与抓取模块、等离子体处理模块、双喷嘴皮升级液滴分配模块、湿度控制压力波样品铺展模块、射流玻璃化与存储模块、以及EasyGrid控制（EGC）质量评估模块。
载网加载系统采用定制化载网架，支持标准的3毫米直径冷冻电镜载网。自动化金属夹持器由三轴笛卡尔机器人驱动，配备双摄像头系统用于校准夹持位置和实时监控载网状态。等离子体处理模块采用大气压等离子体炬，输出功率为1kVA、频率为21kHz，通过载网在炬前12毫米处往复运动5至10次来实现载网表面的亲水化处理。
样品分配系统由两个定制化的压电式皮升级液滴分配头组成，温度可在4至37℃之间调控。该分配头能够以每秒1000滴的速率释放约50皮升的液滴，一次上样可制备至少30个载网。在正式点样之前，系统通过频闪观测模块对压电元件进行调谐，以确保液滴的单分散性。
EasyGrid最核心的技术创新之一是其无印迹压力波样品铺展系统。该系统由两个以掠射角对准载网两侧的喷嘴组成，安装在一个独立的小型温控腔内，腔内湿度通常维持在85%以上以减少样品蒸发。喷嘴以过滤压缩空气为动力，通过过采样数字输出模块（开关时间约1微秒）精确控制压力脉冲的时序和重复性。对于生化溶液样品，典型的铺展时间为30毫秒；对于细胞样品，需要400毫秒的压力波处理以去除多余培养基。铺展完成后，载网在200毫秒内被转移到射流玻璃化模块。
玻璃化模块包含一个自动补充液氮的杜瓦瓶、温控乙烷储液器和两个相对喷射的乙烷喷嘴。乙烷通过加压储液器推动至喷嘴口，当对撞射流稳定约500毫秒后，载网被驱动至射流碰撞点完成玻璃化。载网随后被置于-180℃的氮气蒸气中防止解冻和冰污染，最后插入存储模块的旋转架中，每个旋转架可容纳十个定制化冷冻盒，每个盒子包含四个载网槽位和一个RFID芯片用于样品追踪。
EasyGrid控制模块（EGC）既可以集成在EasyGrid主机中，也可以作为独立的冰层厚度测绘设备使用。该模块采用数字全息显微术（DHM）原理，将激光束分为未调制的参考光束和穿过样品的测量光束，两者重新合束后产生干涉全息图，通过相位解包裹分析获得载网上各位置的冰层厚度信息。EGC提供三种成像模式：2倍放大倍率（约3微米/像素）的全载网厚度图谱，可在约5分钟内完成整体样品质量评估；10倍放大倍率（约0.6微米/像素）的拼接筛查模式，以9×9的瓦片拼接方式成像单个方格区域；以及10倍放大倍率的定量厚度测绘模式，通过2倍图谱的校准实现绝对冰层厚度测量。研究团队验证了EGC测量结果与冷冻电镜图谱及电子断层扫描数据的一致性，证实了该模块作为成本效益型载网预筛选工具的可靠性。
为了证明EasyGrid在SPA样品制备方面的适用性，研究团队选择了多个不同性质的生物大分子复合物进行测试，包括人源脱铁铁蛋白（apoferritin）、酵母核糖体、KR2细菌视紫红质五聚体、胍基酶以及INO80-核小体复合物。所有样品均通过EasyGrid的自动化工作流程完成载网制备，包括等离子体处理、点样、压力波铺展和射流玻璃化等步骤。
冷冻电镜数据采集和处理在多个不同的电镜平台上完成。人源脱铁铁蛋白和酵母核糖体样品在配备Falcon4i直接电子探测器和Selectris X能量过滤器的Titan Krios G4i透射电镜上采集数据。KR2视紫红质样品在欧洲同步辐射装置的Titan Krios G3电镜上采集。INO80-核小体和胍基酶样品则在EMBL Grenoble的Glacios电镜上完成数据采集。
数据处理分别采用RELION和cryoSPARC等标准软件流程。最终获得了五个样品的高分辨率三维结构：脱铁铁蛋白达到1.9Å分辨率（来自188,570个颗粒），酵母核糖体达到2.43Å分辨率（来自135,490个颗粒），KR2视紫红质达到2.32Å分辨率（来自333,078个颗粒），胍基酶达到3.09Å分辨率（来自119,931个颗粒），INO80-核小体复合物达到5.45Å分辨率（来自71,058个颗粒）。这些结果充分表明EasyGrid制备的载网质量能够满足近原子分辨率结构解析的要求。
特别值得关注的是KR2视紫红质的结果。此前该蛋白仅通过X射线晶体学在2.2Å分辨率下获得了结构，而本研究通过EasyGrid制样获得的2.32Å冷冻电镜结构揭示了若干新的结构特征：包括在席夫碱腔中解析到四个水分子（晶体结构仅解析到三个），以及脂质分子在蛋白间裂隙中的不同构象组织，提示KR2复合物中脂质-蛋白相互作用的柔性。
针对冷冻电子断层扫描应用，研究团队将HeLa Tokyo细胞培养在微图案化的金网/SiO2支撑膜载网上，分别使用EasyGrid射流玻璃化和传统Leica GP2投入式冷冻仪制备样品，随后使用双束聚焦离子束/扫描电子显微镜（FIB-SEM）在细胞中部制备约190纳米厚的薄片。通过对薄片进行系统性的高分辨率冷冻电镜栅格成像（像素尺寸1.2Å，共获得18,160张来自20个投入式冷冻细胞薄片的图像和11,688张来自16个射流玻璃化细胞薄片的图像），并分析二维傅里叶变换中的冰衍射环特征，将每个采样位置分类为“完全玻璃态”“半结晶态”或“完全结晶态”。
定量分析结果显示，EasyGrid射流玻璃化的细胞样品中，77±14%的采样位置呈完全玻璃态，而传统投入式冷冻的细胞样品中仅有11±24%的位置呈完全玻璃态。这一显著差异表明EasyGrid的射流玻璃化技术能够提供远高于传统方法的冷却速率，有效抑制了大体积细胞内部冰晶的形成。在SUM159人乳腺癌细胞中也观察到了类似的改善趋势，进一步证实了该方法的普适性。此外，通过冷冻电镜断层扫描和子断层平均技术，研究团队从EasyGrid制备的HeLa细胞薄片中成功重建了6.8Å分辨率的核糖体结构，证明了该方法支持高分辨率的原位结构生物学研究。
EasyGrid平台的核心价值在于将冷冻电镜样品制备的多个关键步骤整合到一个自动化程度极高的系统中，大幅降低了人为操作带来的不确定性和批次间差异，同时显著提高了样品制备的通量和可重复性。EGC质量控制模块的引入更是一个重要创新，它使研究者能够在投入昂贵的冷冻电镜机时之前，以极低的成本和时间对载网进行全面评估和筛选，这对于资源有限的研究团队尤其具有实际意义。
在技术层面，EasyGrid的压力波铺展系统在几十到几百毫秒内即可完成样品铺展，远快于传统印迹法的数秒操作时间，且避免了印迹滤纸可能引入的污染物。这种快速铺展能力对于制备不稳定样品薄膜至关重要。同时，该系统不依赖于物理接触，因此也适用于细胞样品的培养基去除，这是其他微流控或针印式设备难以实现的功能。
从应用前景来看，EasyGrid的模块化设计允许灵活配置，EGC可以作为独立设备单独部署，服务于缺乏电镜资源的实验室。未来版本的设备将引入更高放大倍率的光学系统（至50倍），以实现单个载网孔洞级别的冰层厚度测量，并计划整合荧光显微镜模块和神经网络驱动的自动图谱分析。此外，精确的样品分配控制和时间分辨率使EasyGrid有望与快速混合技术结合，用于时间分辨冷冻电镜实验，捕捉生化反应中的瞬时中间态。研究团队还计划将该技术推广至其他结构生物学实验室和设施，并正在评估其在纳米X射线成像等领域的应用潜力。