本文报道了一项原创性研究，以下为该研究的学术报告。

一、作者、机构与发表信息

该研究由Halston Deal和Elizabeth M. Byrnes（共同第一作者）、Sanika Pandit、Halle J. Cantor、Muskan Aslam、Stacy Ban、Megan Palmisano、Rosemary Bayless、Ashley C. Brown及Michael Daniele等人完成。研究机构包括北卡罗来纳州立大学与北卡罗来纳大学教堂山分校联合生物医学工程系、北卡罗来纳州立大学比较医学研究所、弗吉尼亚大学生物医学工程系、北卡罗来纳州立大学分子生物医学科学系以及电气与计算机工程系。通讯作者为Ashley C. Brown（aecarso2@ncsu.edu）与Michael Daniele（mdaniel6@ncsu.edu）。该论文发表于《Advanced Functional Materials》期刊，2026年第36卷，文章编号e31169，DOI为10.1002/adfm.202531169，并于2026年2月5日正式接收发表。

二、研究背景与目的

本研究属于生物材料表征与微流控技术交叉领域。纤维蛋白（fibrin）在人体中具有双重角色：在伤口修复中作为引导细胞迁移的临时支架，同时在血栓形成中作为病理性基质。纤维蛋白的运输特性（transport properties）、可降解性（degradability）以及细胞重塑（cellular remodeling）能力在不同生化条件、工程条件乃至患者特异性条件下会发生显著变化，因此亟需能够对这些特性进行多重分析的实验工具。已有研究表明，纤维蛋白网络密度、渗透性（permeability）与纤溶抵抗性（fibrinolytic resistance）三者密切相关——更致密的纤维蛋白网络通常降低渗透性并限制纤溶作用。然而，传统渗透性评估方法需要组装移液管、管道、烧杯和铁架台等笨重设备，且所需样品体积较大。纤溶评估以往多在Chandler环或微流控装置中进行，但各个测试之间实验条件不统一，难以直接比较。此外，糖尿病、心血管疾病、吸烟者等病理状态常伴随纤维蛋白原的糖化或氧化，导致更致密、更不易渗透且对纤溶更具抵抗力的凝块形成。因此，本研究旨在开发一种单一通道、H型连接（H-junction）的微流控平台，在同一水凝胶中实现纤维蛋白渗透性、纤溶动力学、成纤维细胞侵袭以及凝块延伸的多重实时定量分析，以弥合机制性纤维蛋白研究与转化生物材料设计之间的鸿沟。

三、研究流程与实验方法

本研究的工作流程可概括为四个主要实验模块，外加若干辅助表征。

第一模块为微流控装置的设计与制备。研究团队设计了一种H型微流控平台，包含两条通过1.5毫米宽的界面通道（interfacial channel）连接的通道。流动通道（flow channel）与纤维蛋白通道（fibrin channel）高度为240微米，界面通道高度为130微米。装置模具采用AutoCAD设计并导出为STL文件，使用Profluidics 285D微流控打印机以50微米层厚打印。模具清洗后使用PDMS（聚二甲基硅氧烷）以10:1比例倒模，固化后打孔并与玻璃载玻片等离子键合。对于细胞迁移实验，装置预先用聚-D-赖氨酸（poly-D-lysine，PDL）处理以增强纤维蛋白与PDMS及玻璃的附着。这一装置设计使所有测量均在约3微升凝胶体积的共享关注区域（region of interest）内完成，实现了标准化成像与统一量化流程。

第二模块为渗透性（permeability）测量。制备不同浓度（1.5、5和10 mg/mL）的成人纤维蛋白凝块，以及1.5 mg/mL的成人或胎儿（fetal）纤维蛋白凝块，部分凝块添加20 µg/mL的凝血因子XIII（FXIII）或FXIII抑制剂tridegin。所有凝块含0.5 U/mL凝血酶、0.025 M HEPES、0.15 M NaCl、0.01 M CaCl₂及10 µg/mL Alexa Fluor 488标记的纤维蛋白原。凝块注入纤维蛋白通道聚合至少3小时。随后以10 µL/min的流速在流动通道中灌注12.5 µg/mL的70 kDa Texas Red葡聚糖（用于浓度梯度实验）或10 µg/mL罗丹明B（用于成人/胎儿对比实验）。使用Leica Stellaris 5共聚焦显微镜每1分钟采集一次图像，持续12或30分钟。渗透系数（permeability coefficient）通过公式P=(∂I_F/∂t)(V_F/(I_max A_F))计算，其中∂I_F为纤维蛋白凝胶内染料浓度的变化，I_max为凝胶界面处最大染料浓度，V_F为染料扩散体积，A_F为界面面积。研究设定了排除标准：若染料分布演变不对称、提示对流绕过或部分凝胶剥离，则该装置数据被排除。

第三模块为纤溶动力学（fibrinolysis）测量。实验设计类似于渗透性实验，但流动通道中灌注的是10或50 µg/mL的人纤溶酶（plasmin）而非染料。通过记录荧光纤维蛋白凝胶信号的衰减来量化纤溶程度。图像经二值化处理后测量纤维蛋白面积随时间的变化，计算30分钟内的面积损失或荧光信号下降百分比。

第四模块为成纤维细胞侵袭（fibroblast invasion）评估。使用新生儿包皮来源的人真皮成纤维细胞（HDFN），传代5至9代用于实验。先将纤维蛋白凝块注入纤维蛋白通道聚合1小时，然后将染有CellTracker Red CMTPX的HDFN以10⁷细胞/mL的密度接种到流动通道中。装置倾斜置于培养箱15–30分钟以促进细胞附着。细胞在1、3、5和/或7天进行共聚焦成像，成像时使用10倍物镜获取200微米z-stack。在第5或7天，细胞经4%多聚甲醛固定，0.1% Triton X-100通透，2% BSA封闭，iFluor-488鬼笔环肽染色纤维状肌动蛋白，DAPI染色细胞核。使用ImageJ软件进行细胞侵袭面积和细胞核计数定量，核方向性则通过ImageJ的Directionality功能分析，傅里叶分量分析中使用181个bin从-90°到+90°评估核长轴相对于起始边界的取向分布。

第五模块为全血凝块生长（clot growth）观察。使用5 mg/mL Alexa Fluor 488标记的成人纤维蛋白原制备凝块。从健康成年马静脉穿刺采集柠檬酸钠抗凝全血，在灌注前加入10 µg/mL Alexa Fluor 546标记的纤维蛋白原以及0或0.01 M CaCl₂。以10 µL/min流速灌注，监测30分钟，测量纤维蛋白边缘处546通道荧光强度的增长。

辅助表征包括：96孔板中的350 nm吸光度法评估纤维蛋白聚合动力学和纤溶；高倍共聚焦成像（63倍水浸物镜）评估纤维蛋白网络密度，将最大强度投影图像二值化后计算纤维蛋白像素所占百分比；SDS-PAGE电泳结合密度测定评估FXIII介导的γ链交联程度；以及使用KLA Corp Filmetrics Profilm3D光学白光轮廓仪测量微通道特征高度。统计方面，对于三组及以上比较采用Brown-Forsythe和Welch单因素方差分析（方差非齐时），或Kruskal-Wallis非参数检验；因子比较采用双因素方差分析；双侧检验α=0.05。

四、主要研究结果

渗透性实验显示，随着纤维蛋白原浓度从1.5 mg/mL增加到5和10 mg/mL，70 kDa Texas Red葡聚糖的渗透系数从7.35×10⁻⁵ cm²/s分别降至2.60×10⁻⁵ cm²/s（p=0.03）和1.98×10⁻⁵ cm²/s（p=0.01），整体跨度达3.7倍。FXIII使1.5 mg/mL成人纤维蛋白的表观渗透性从7.35×10⁻⁵降至4.54×10⁻⁵ cm²/s，但未达到统计学显著（p=0.20）。在成人/胎儿对比中，胎儿纤维蛋白对罗丹明B的渗透系数显著更高（p<0.01），特别是在FXIII处理组中。高倍共聚焦成像显示纤维像素密度随纤维蛋白浓度增加而升高（17.4±2.00%、22.3±2.12%、35.1±3.87%），胎儿纤维蛋白密度显著低于成人纤维蛋白（12.6±5.45% vs. 18.8±5.82%，p<0.01），这些结构与渗透性趋势一致。

纤溶实验结果揭示，成人纤维蛋白的裂解速率随浓度增加而显著减慢：1.5、5和10 mg/mL纤维蛋白在30分钟内分别损失1.76±0.317、0.802±0.170和0.327±0.070 mm²面积，即纤溶半衰期（fibrinolysis half-time）最短可至12分钟，且浓度梯度产生近9倍的裂解速率差异。胎儿纤维蛋白在溶栓初期6分钟内丢失11.4±1.20%/min的荧光信号，显著快于成人纤维蛋白的4.03±0.929%/min（p<0.01）。关键发现是，FXIII对胎儿纤维蛋白的纤溶抵抗性有显著保护作用（p<0.01），但对成人纤维蛋白无显著影响。这一结果支持了纤维蛋白在低剪切或静态条件下形成时，FXIII交联可通过压缩纤维、降低渗透性从而减缓纤溶酶渗透的观点。

成纤维细胞侵袭实验表明，1.5 mg/mL纤维蛋白支持最深的三维侵袭，可测量数量的细胞迁移距离超过750微米。5 mg/mL纤维蛋白显著限制了侵袭（p值显著），但有趣的是10 mg/mL纤维蛋白在总侵袭细胞数量上与1.5 mg/mL相似，只是10 mg/mL凝胶中的迁移模式从深层三维侵袭转变为沿玻璃底面的二维平面迁移，可能借助表面纤溶形成的通道。在成人/胎儿对比中，胎儿纤维蛋白在第5天支持显著更多的HDFN侵袭（相较成人+FXIII组p=0.03，相较成人-FXIII组p=0.04），FXIII处理的胎儿纤维蛋白诱导最高的细胞方向性，更多细胞核垂直于起始边界排列。500–1000微米（p=0.01）和1000–1500微米（p=0.05）距离段的迁移细胞数差异最为显著。

全血凝块生长实验显示，复钙化（加入CaCl₂）的全血在30分钟内纤维蛋白界面处荧光达到1.57±0.669 a.u.，明显高于未复钙化组的0.705±0.046 a.u.（p<0.01），证实了钙对凝血级联激活、血小板黏附及纤维蛋白聚合的必要性。

五、研究结论与价值

本研究成功开发并验证了一种单一H型微流控平台，可在约3微升凝胶体积内完成纤维蛋白渗透性、纤溶动力学、成纤维细胞侵袭和凝块延伸的多重实时定量分析。研究发现纤维蛋白原浓度从1.5至10 mg/mL可产生3.7倍渗透性跨度、9倍裂解速率变化以及最高64%的成纤维细胞穿透抑制。胎儿纤维蛋白表现出更高的渗透性、更快的纤溶和更利于成纤维细胞侵袭的再生性基质表型。FXIII交联对成人纤维蛋白特性影响温和，但可显著增强胎儿凝块的纤溶抵抗性。该平台具有低样品消耗、高分辨率、与标准显微镜兼容及实时定量分析等优势，有望作为抗凝药物筛选、促愈合治疗开发及患者特异性风险评估的高通量工具，并可进一步集成平面电极实现在线传感，或与内皮界面和剪切流结合以扩展至更复杂的血管病理生理模型。其科学价值在于为纤维蛋白结构-功能关系研究提供了统一的实验框架，应用价值则体现在生物材料设计、血栓溶解药物筛选和精准医学评估等多个方向。

六、研究亮点

第一，方法学上，该研究以一个单一装置同时实现了四种不同但高度相关的纤维蛋白功能分析，极大提高了实验效率和可比性。第二，设计上采用横向排列的H型通道，有利于与平面电极集成，为未来在线传感留出空间。第三，关注对象上，将成人与胎儿纤维蛋白及FXIII交联效应并置比较，在纤溶抵抗性方面获得了FXIII对胎儿纤维蛋白具有选择性保护作用的新发现。第四，排除了对流伪影对渗透性测量的干扰，通过预设“对流特征”排除标准保证了数据的可靠性，这一点在微流控渗透实验中尤为关键。

七、其他有价值的内容

作者认可的局限性包括：部分渗透性和迁移实验的样本量（n=3–7）仅基于初步验证需求，统计效能有限，因此未达到显著的比较结果应谨慎解释为“证据不足”而非“等效证据”。此外，当前的实验结果仅支持唾液酸与纤维蛋白功能之间的相关性，未来需要定向的去唾液酸化对照实验来验证因果关系。这些讨论为后续研究在样本量设计、实验对照设置以及纤溶机制深入研究等方面提供了明确的方向指导。