Kim, Young-Teck等作者在《Carbohydrate Research》期刊上发表了一项关于利用核磁共振波谱（NMR spectroscopy）对β-D-(1→3, 1→6)-连接葡聚糖（β-D-(1→3, 1→6)-linked glucans）进行结构表征的研究。该研究发表于2000年，第328卷，第331至341页。主要作者来自韩国大学生物技术研究生院（Graduate School of Biotechnology, Korea University）、韩国基础科学研究院磁共振团队（Magnetic Resonance Team, Korea Basic Science Institute）以及美国詹姆斯·H·奎伦医学院外科系（Department of Surgery, James H. Quillen College of Medicine）。
该研究属于多糖结构分析领域，其学术背景在于，β-D-(1→3, 1→6)-连接葡聚糖具有免疫增强和刺激活性，被称为生物反应调节剂（biological response modifiers, BRMs），其分子量（molecular weight）和水溶性等关键理化性质取决于分支度（degree of branching, DB）和化学修饰。然而，传统的结构分析方法存在局限性：如甲基化分析耗时且需谨慎预处理；酶解法不适用于所有葡聚糖；而13C NMR分析则灵敏度低、所需样品量大。因此，该研究旨在开发一种利用1H NMR波谱无损、简单地测定β-葡聚糖的聚合度（degree of polymerization, DP）和分支度（DB）的方法，并能对糖环上不同位置（anomeric）的质子进行完整归属。
研究的详细工作流程和主要结果分为几个部分。首先，研究者解决了一个关键技术难题，即NMR溶剂的选择。他们指出，尽管二甲基亚砜（Me2SO-d6）能防止分子聚集、提供比水溶剂更好的信号分辨率，但糖环羟基（OH）峰的干扰会严重影响定量分析。为此，他们首创性地引入了6:1的Me2SO-d6与D2O混合溶剂体系，并在80°C下进行检测。这一创新方法有效消除了羟基质子峰，使得原本被掩盖的异头碳上的质子（H-1）信号清晰显现，同时增加了部分分子流动性，成功分离了非还原端（nonreducing terminal, NRT）和β-异头构型还原端质子的信号。
其次，研究人员利用一系列标准品和已知结构的葡聚糖，对异头质子进行了系统性归属。他们使用了昆布二糖（laminarabiose）、龙胆二糖（gentiobiose）、昆布五糖（laminarapentaose）和昆布七糖（laminaraheptaose）等线性寡糖作为模型。通过分析这些标准品的1H NMR谱图，并辅以二维相关谱（COSY）和异核多量子相关谱（HMQC），研究人员准确归属了不同位置上葡萄糖单元（anhydroglucose units, AGUs）的H-1信号。具体而言，在混合溶剂中，还原端（reducing terminal, RT）的α-和β-异头质子分别被归属在5.02–5.03 ppm（耦合常数J = 3.6–3.7 Hz）和4.42–4.43 ppm（J = 7.6–7.9 Hz）；内部AGUs和β-(1→6)分支AGUs的H-1质子则分别出现在4.56–4.59 ppm和4.26–4.28 ppm。此外，对昆布寡糖的还原产物进行分析，进一步确认了非还原端H-1（4.45–4.46 ppm）和紧邻还原端的第二个AGU的H-1（4.51–4.53 ppm）的归属。这一归属过程为后续定量分析奠定了坚实基础。
基于上述归属，研究者建立了计算DPn（数均聚合度）和DB的公式。DPn等于所有H-1峰面积除以还原端H-1峰面积，或所有H-1峰面积除以非还原端H-1峰面积。DB则等于侧链末端AGU（TSC）的H-1峰面积除以主链上所有AGU的H-1峰面积。
在结果部分，研究团队应用此方法对一系列具有不同结构和溶解性的β-葡聚糖进行了详细分析。对于从Laminaria digitata中提取的昆布多糖（laminaran），其1H NMR谱图清晰地显示了主链和侧链的信号。除了主链上的各H-1信号外，在4.28 ppm和4.34 ppm处观察到两个属于侧链的β-(1→6)-连接H-1信号，其中4.28 ppm被归属为侧链中的单糖或末端AGU（TSC），而4.34 ppm被归属为侧链中长度大于一个糖基时的内部AGU（SC）。计算得出昆布多糖的DPn为33，而通过高效尺寸排阻色谱-多角度激光光散射-示差折光检测器（HPSEC-MALLS-RI）测得的绝对重均聚合度（DPw）为37，鉴于其1.12的多分散性，两者结果吻合。其DB计算值为0.07，与先前报道的0.06一致。
对于水不溶性酵母葡聚糖（yeast glucan），研究发现其DPn为218，与MALLS系统分析结果（DPn 219）高度一致。该方法还精确测定了其极低的DB值（0.003）以及α与β异头构型的比例为1:1.02，展现了传统方法难以达到的分析能力。在其磷酸化衍生物——可溶性酵母葡聚糖磷酸酯（yeast glucan phosphate）的分析中，DPn测定为210，与前人因分子聚集而差异巨大的数据（137-450）相比更接近未修饰的酵母葡聚糖。其DB值为0.02，与水不溶性酵母葡聚糖的DB差异揭示了不同提取过程对分子结构的影响。
在对可德兰多糖（curdlan）的分析中，研究揭示了一个重要发现：溶剂中水含量会影响测量结果。在Me2SO-d6与D2O比例为6:1时，测得DPn为163，但当Me2SO-d6比例增加至9:1时，DPn增至225，这归因于水含量变化导致的溶解度和构象改变。其DB计算结果为0，证实了其线性结构。
对于茯苓聚糖（pachyman），该方法成功测定了其高达540的DPn和0.003的极低DB值，这是文中报道的利用NMR分析的分子量最大的β-D-葡聚糖。
在分析核盘菌多糖（scleroglucan）时，尽管因其分子量过大（DPn约9700）而无法测得末端信号来计算DPn，但其谱图完美地验证了其高分支结构。谱图中内部主链H-1与侧链H-1的积分比恰好为3:1，精确计算出DB值为0.33，与之前报道的数据高度吻合。同时，内部H-1呈现的三个双峰以及13C谱中清晰可分辩的四个C-1信号，均证实其主链为三聚体重复单元，且侧链仅含一个葡萄糖单元，并表明该聚合物在溶液中以单链无规卷曲构象存在。
研究结论强调了该方法的价值与意义。科学价值在于，它第一次实现了对β-D-(1→3, 1→6)-连接葡聚糖中所有不同位置上异头质子的完全归属，并建立了一种普适性强、非破坏性的NMR分析方法，可精确测定从低分子量寡糖到高分子量多糖（DPn高达540）的DPn和DB。应用价值在于，该方法操作简单，所需样品量少，且能克服传统方法的诸多局限，为BRMs类葡聚糖药物的质量控制、结构-活性关系研究及其临床应用的筛选提供了强有力的分析工具。
研究的亮点如下：第一，发现了6:1的Me2SO-d6/D2O混合溶剂体系，创造性地解决了活泼氢干扰，这是实现精确定量分析的关键；第二，通过系统研究标准品及还原产物，完成了对多糖谱图中所有微小但关键的末端和连接位置异头质子信号的精确化学位移归属；第三，该方法兼具非破坏性和高灵敏度的优点，能够检测出如DB值低至0.003的极微量分支结构，并发现溶剂组成对DP测量有显著影响。此外，该方法的应用范围广泛，适用于从昆布多糖、酵母葡聚糖到茯苓聚糖等一系列不同来源、不同溶解度和不同分支结构的β-葡聚糖。