王洪涛等人于2021年在《Cell Stem Cell》期刊上发表了一项关于解码人类巨核细胞发育的开创性研究。该研究由来自中国医学科学院血液病医院、军事科学院军事医学研究院、天津市中心妇产科医院等多个单位的科研人员合作完成，通讯作者为石莉红、刘兵和周家喜。
该研究属于干细胞生物学与发育血液学领域。巨核细胞是骨髓中一类体积巨大但数量稀少的造血细胞，负责产生血小板，并在凝血、炎症、血管生成及先天免疫中发挥关键作用。然而，由于人类胚胎及胎儿组织获取困难，早期胚胎发育阶段的巨核细胞生成过程一直未得到充分阐明。已有研究多集中于红细胞和造血干祖细胞，对巨核细胞在体内的分子特征、细胞异质性和发育轨迹知之甚少。为解决这一知识空白，该研究旨在利用单细胞RNA测序技术，系统解析来自人胚胎卵黄囊和胎肝的原代巨核细胞以及人胚胎干细胞来源的巨核细胞，从而绘制早期人类巨核细胞生成的全面转录组图谱。
研究团队设计了系统且严谨的实验流程。首先，他们收集了孕4周的人类卵黄囊和孕8周的胎肝样本，通过不同的细胞富集方法获取单细胞悬液，并利用10x Genomics平台进行高通量单细胞RNA测序。随后，他们采用生物信息学方法对测序数据进行质量控制、细胞聚类和降维分析，基于已知的标记基因鉴定了包括巨核细胞在内的多种细胞类型。为验证初期发现，研究者从另外三个卵黄囊和四个胎肝样本中分选出总巨核细胞，并使用SMART-seq2平台进行单细胞测序，以确认细胞亚群的存在。在机制探索阶段，他们使用Monocle 2算法对巨核细胞群体进行了拟时序和发育轨迹分析，利用分支表达分析模型识别基因表达模块，并构建了转录因子调控网络。接下来，研究团队利用先前建立的人胚胎干细胞逐步诱导分化体系，在体外将人胚胎干细胞分化为巨核细胞，并在不同时间点收集造血细胞进行单细胞RNA测序，以评估该体外模型在多大程度上能重现体内巨核细胞生成的异质性。最后，为寻找能够追踪巨核细胞发育早期阶段的标志物，他们通过基因相关性分析，筛选与已知巨核细胞标记基因PF4表达模式正相关的候选基因。特别地，他们利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，在人胚胎干细胞中构建了THBS1-GFP报告细胞系和THBS1敲除细胞系，通过流式细胞术、免疫荧光和血小板生成功能实验，系统验证了THBS1作为早期标记物的有效性以及其在巨核细胞特化中的功能。
研究取得了一系列重要发现。在卵黄囊和胎肝的单细胞转录组分析中，研究成功捕获了数以万计的细胞，并鉴定了包括巨核细胞在内的多个细胞群。他们发现，两个位点的巨核细胞存在显著差异：胎肝来源的巨核细胞多倍体比例更高，且高表达细胞周期相关基因；而卵黄囊来源的巨核细胞则富集糖酵解相关基因通路。这些发现提示两个造血位点的巨核细胞生成具有不同的代谢和增殖特征。
更深层次的分析揭示了巨核细胞内部的转录组异质性。通过将两个来源的巨核细胞合并分析，研究团队识别出六个具有不同基因表达谱的亚群。其中，MK3亚群高表达与止血和凝血相关的基因，可能代表执行经典血小板产生功能的亚群；MK4亚群高表达细胞外基质成分和多种已知能调节造血干细胞活性的基因，例如IGFBP3和PTN，提示其可能扮演着“微环境支持”的角色；尤为引人注目的是MK6亚群，它不仅高表达特征性的巨噬细胞基因C1QC，还富集了众多与免疫应答相关的基因和通路，如MAFB、S100A9和C3AR1等，预示其可能是一个具有免疫功能的巨核细胞新亚群。后续的SMART-seq2测序数据成功验证了这些亚群的稳定存在及其特征基因签名。通过发育轨迹分析，研究发现这些功能各异的亚群是沿着两条不同的发育路径产生的：一条走向血小板生成，另一条则导向免疫应答和微环境支持功能，这一发现为巨核细胞的功能多样性提供了分子层面的解释。
在体外模型验证方面，研究显示人胚胎干细胞来源的巨核细胞同样存在异质性，其中hesc-MK4亚群与原代组织中的免疫样巨核细胞高度相似，均高表达免疫相关基因和单核-巨噬细胞表面标记物CD14。流式细胞术进一步证实，在胎肝和人胚胎干细胞分化体系中，均能检测到CD41a+CD42b+CD14+的免疫特征巨核细胞，这表明体外分化模型能够部分重现体内巨核细胞发育的复杂性。
在寻找早期标记物方面，研究通过对基因表达相关性的交叉分析，锁定了THBS1等四个候选基因。利用构建的THBS1-GFP报告人胚胎干细胞系，团队发现GFP信号在造血分化的第5天即可在内皮细胞中检测到，并在第7天于造血祖细胞中出现，这远早于经典晚期巨核细胞标记CD42b的表达。功能实验显示，相比于GFP阴性细胞，分选的CD31+CD43-CD45-GFP+内皮细胞和CD43+GFP+造血祖细胞在后续分化中，产生CD42b+巨核细胞的效率分别提高了约4倍和5倍，血小板的生成量也显著增加。这些结果表明，THBS1能够标记一群向巨核细胞谱系定向分化的内皮细胞和造血祖细胞，并且这种命运决定可能早至内皮细胞阶段就已发生。而THBS1基因敲除实验显示，该基因缺失对巨核细胞的特化影响甚微，表明THBS1是一个发育阶段标记物而非功能性决定因子。
本研究的主要结论是，早期人类巨核细胞是包含多个转录组和功能各异亚群的异质性群体，这些亚群可能通过不同的发育路径产生，以分别承担止血、免疫调节和微环境支持等多样化功能。研究不仅提供了早期人类巨核细胞生成的宝贵单细胞转录组资源库，还鉴定出CD14+免疫特性巨核细胞亚群，并首次发现THBS1可作为标记巨核细胞偏向性内皮细胞的早期标志物。
该研究的科学价值和应用价值深远。首先，它极大地填补了人类早期胚胎造血发育知识体系中关于巨核细胞认识的空白，为深入探究巨核细胞的分化机制及其在生理与病理条件下的角色奠定了坚实基础。其次，免疫相关巨核细胞亚群的发现，革新了我们对巨核细胞功能单一性的传统认知，为理解其如何参与机体的免疫调控，特别是近年来发现的肺部等组织中的免疫活性巨核细胞来源，提供了重要线索。最后，THBS1报告细胞系和基于人胚胎干细胞的分化模型的建立，为实时追踪人类巨核细胞和血小板的生成过程提供了有力的工具，这不仅有助于评估和改进体外血小板生产效率以满足临床输注需求，也为研究巨核细胞发育相关疾病的发病机理和药物筛选提供了理想的平台。
本研究的亮点和创新点主要体现在以下几个方面：第一，研究对象的稀缺性和宝贵性。它成功获取了人胚胎卵黄囊和胎肝组织，并对其中极为罕见的巨核细胞进行了系统性的单细胞转录组分析，这在以往的研究中难以实现。第二，发现的突破性。研究首次揭示了早期人类巨核细胞的全面异质性，并定义了一个独特的CD14+免疫亚群及其分化的特定发育轨迹，将巨核细胞的功能分工推向了单细胞水平。第三，方法学的创新与整合。研究巧妙地将体内原代组织分析、体外干细胞分化模型和CRISPR-Cas9基因编辑技术相结合，不仅验证了体外模型对体内发育过程的模拟能力，还成功开发了能够捕捉巨核谱系早期命运决定的THBS1报告系统，为造血发育研究中命运决定节点的追踪提供了新范式。