本研究由Emma Lefrançais、Guadalupe Ortiz-Muñoz及Mark R. Looney等人完成，主要作者来自University of California, San Francisco (UCSF)的Department of Medicine、Department of Pathology及Cardiovascular Research Institute，同时包括University of California, Los Angeles (UCLA)的研究人员。该研究发表于Nature，于2017年4月6日正式刊出，文章标题为“The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for hematopoietic progenitors”。该研究首次通过活体成像直接证明肺是血小板生成的主要场所之一，并揭示肺中存在具有造血重建潜能的造血祖细胞群。
在学术背景方面，血小板在止血、血栓形成和炎症反应中具有关键作用，但成熟血小板产生的机制一直未被完全阐明。传统上，骨髓被认为是血小板生成的主要部位，而有间接证据提示肺可能参与血小板生物发生。肺是心输出后第一个遇到的毛细血管床，既往研究曾观察到肺中存在巨核细胞，并且肺动脉与肺静脉血液中的血小板和巨核细胞数量存在差异。然而，由于缺乏直接成像手段，肺在血小板生成中的具体贡献始终未被量化。本研究旨在利用肺活体双光子显微镜直接观察肺微循环中巨核细胞的行为，并进一步探究肺内造血祖细胞是否具备迁移至骨髓并恢复造血功能的能力。
研究流程可分为几个主要部分。首先，研究者使用pf4-cre × mTmG报告小鼠，该小鼠中巨核细胞和血小板表达膜定位GFP，其他细胞表达膜定位Tomato。通过肺双光子活体显微镜，直接观察到体积较大的GFP阳性细胞在肺微循环中随血流通过并动态释放GFP阳性血小板。这些细胞在肺血管中形成前血小板样突起，释放过程持续约20至60分钟，且细胞核保持完整，释放后留下裸露的细胞核。为确认这些细胞确实为有核巨核细胞，研究者进一步使用pf4-cre × nTnG小鼠，通过核定位GFP加以验证。在定量分析中，根据表面体积计算，肺循环中的巨核细胞中位体积约10000 μm³，直径大于25 μm，血小板体积小于10 μm³。每个巨核细胞可释放约500个血小板，范围为小于500至超过1000个不等。在每次约2小时的成像中，10只小鼠平均每小时在0.07 mm³的成像体积内观察到2.2个发生血小板释放的巨核细胞。根据肺总体积推算，肺每小时可产生超过1000万个血小板，约占小鼠全身血小板总产量的50%。此外，给予促血小板生成素可显著增加血小板计数并使肺中发生前血小板形成的巨核细胞数量增加约2倍，表明肺的血小板生成具有可调节性。
为了明确肺血管中巨核细胞的来源，研究者建立并使用了小鼠原位单肺移植模型。将mTmG供体肺移植到pf4-mTmG受体后，可在移植肺中观察到来源于受体的GFP阳性巨核细胞在肺血管中释放血小板，而反向移植则无此现象，证明肺循环中释放血小板的巨核细胞来自肺外。进一步成像发现骨髓和脾脏中存在巨核细胞释放前血小板进入血窦的现象，且骨髓中可见大型巨核细胞迁出骨髓腔，而肝脏中未观察到巨核细胞。
研究还发现肺间质中存在常驻巨核细胞。这些细胞位于血管外，体积约为血管内巨核细胞的三分之一，直径约一半，且具有较大且形态复杂的细胞核。通过pf4-cre × Rosa26-tdTomato和pf4-mTmG小鼠成像，以及肺移植中的保留供体肺内细胞，显示这些细胞在数小时成像期间保持静止。图像分析估计每立方毫米肺组织约有2000个pf4阳性细胞，整个肺中超过100万个。利用血管内标记方法，发现约85%的肺巨核细胞位于血管外，15%位于血管内。流式细胞术和RNA测序表明，与骨髓巨核细胞相比，肺巨核细胞更不成熟，Cd41、Cd61和Cd42b表达更低、体积更小、DNA含量更低，但均表达巨核细胞标志物GpVI和c-Mpl，而不表达巨噬细胞标志物F4/80。RNA测序鉴定出超过700个差异表达基因，肺巨核细胞中成熟巨核细胞标志物表达减少，而天然免疫相关通路和趋化因子表达上调。
在功能实验中，研究者利用原位单肺移植模型将pf4-tomato供体肺移植到野生型或c-Mpl基因敲除的血小板减少症受体中，并在移植后第3天和第40天给予促血小板生成素。结果显示，在大多数c-Mpl-/-受体中，移植物来源的血小板可长期产生并持续超过90天，完全恢复外周血小板计数；在部分未使用促血小板生成素的受体中同样观察到持续血小板重建。供体来源的血小板表达Cd42、GpVI和c-Mpl，并可在凝血酶刺激下表达Cd62p，证明其具有正常血小板功能。移植后长达10个月的随访中，受体仍能持续产生供体来源血小板，说明供体肺中存在能够长期重建巨核细胞和血小板的祖细胞群体。此外，mtmg供体肺移植到c-Mpl-/-受体后，骨髓中供体来源的巨核细胞祖细胞、长期造血干细胞、短期造血干细胞及多能祖细胞亚群均显著增加，并部分恢复c-Mpl-/-小鼠的造血干祖细胞缺陷。进一步将野生型肺中分离的LSK细胞和短期造血干细胞经静脉注射到c-Mpl-/-小鼠后，可增加外周血中c-Mpl阳性血小板并部分恢复血小板计数，证明肺中的造血祖细胞具有迁移至骨髓、植入并重建血小板生成的功能。同时，移植后供体来源的成熟血细胞还包括中性粒细胞、B细胞和T细胞，表明肺来源的造血祖细胞具备多谱系分化能力。
在讨论与结论中，作者指出肺作为血小板生物发生的主要部位，其机制与骨髓不同：骨髓中巨核细胞在血窦外释放前血小板，而肺中则是由来自肺外的完整巨核细胞在肺微循环血管内直接释放血小板。肺不仅是血小板生成的生物反应器，还是巨核细胞和造血祖细胞的储存库。肺血管中的高剪切力、高水平的血管性血友病因子以及巨核细胞与内皮细胞间的GpIb-vWF信号可能共同促进前血小板形成和血小板释放。在病理生理意义上，肺中的巨核细胞和造血祖细胞可能在感染时参与应急造血和免疫调节。研究还提示肺移植后嵌合状态可能影响移植物的急慢性排斥反应，并为细胞治疗血小板减少症提供新思路。
本研究的关键亮点包括：首次利用肺双光子活体显微镜直接捕捉到巨核细胞在肺微循环中释放血小板的动态过程；首次定量估计肺贡献约50%的血小板总产量；通过原位单肺移植模型确立肺中巨核细胞的肺外来源；首次在成年肺中鉴定出具有造血重建能力的造血干祖细胞群；并证明肺来源的造血前体细胞可在血小板减少和干细胞缺陷模型中重建骨髓造血功能。研究方法的创新点在于活体肺稳定成像、单肺移植与细胞追踪技术的结合，以及利用不同荧光报告小鼠区分供体与受体来源细胞。
总体而言，该研究改变了肺在造血系统中的传统定位，将其从单纯的呼吸器官拓展为重要的血小板生成场所和造血祖细胞储库，为血小板减少症的治疗、造血干细胞生物学及肺移植免疫学提供了新的理论基础和潜在应用方向。