学术研究报告：抑制microRNA-33b改善非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的治疗潜力

作者及机构
本研究由Sawa Miyagawa、Takahiro Horie等来自日本京都大学医学研究生院心血管医学系、国立医院组织京都医疗中心转化研究部、大阪大学药学院及三菱田边制药公司创新研究部门的21位研究人员共同完成。研究成果于2023年6月1日发表在《Life Science Alliance》期刊（DOI: 10.26508/lsa.202301902）。

学术背景
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD, Non-Alcoholic Fatty Liver Disease)已成为全球最常见的慢性肝病（成人患病率约25%），其进展形式非酒精性脂肪性肝炎(NASH, Non-Alcoholic SteatoHepatitis)可导致肝硬化和肝细胞癌。目前全球尚无获批的NASH治疗药物。本研究聚焦于microRNA-33b（miR-33b）——一种位于固醇调节元件结合转录因子1（SREBF1）内含子中的非编码RNA。人类肝脏高表达miR-33b，而啮齿类动物缺乏该基因。前期研究发现miR-33a（位于SREBF2中）参与胆固醇代谢调控，但miR-33b在NASH中的作用尚不明确。本研究旨在阐明miR-33b在NASH发病机制中的作用，并探索其作为治疗靶点的潜力。

研究流程与方法
1. 动物模型构建
- 开发了miR-33b敲入（KI, Knock-In）小鼠模型：将人类miR-33b序列插入小鼠Srebf1基因的相同内含子位置，构建生理表达miR-33b的”人源化”小鼠。 - 创建了miR-33bfl/fl KI小鼠：通过同源重组在ES细胞中插入loxP-flanked miR-33b序列，经Southern blotting和PCR验证（样本量：6-7只/组）。 - 采用Cre-loxP系统构建细胞特异性敲除模型：与Alb-Cre（肝细胞特异性）或LysM-Cre（巨噬细胞特异性）小鼠杂交。

1. 饮食诱导与治疗实验

   • 高脂饮食(HFD, High-Fat Diet)模型：8周龄雄性小鼠喂食45 kcal% HFD 12周（n=10-11/组）。
   • Gubra Amylin NASH (GAN)饮食模型：含2%胆固醇、40 kcal%脂肪、果糖和棕榈油，比HFD更能诱导严重炎症和纤维化（n=8-10/组）。
   • 反义寡核苷酸(AMO, Anti-miRNA Oligonucleotide)治疗：每两周皮下注射特异性抑制miR-33a/b的核酸药物（10 mg/kg），共7次。

2. 分子生物学分析

   • qRT-PCR检测miR-33a/b及其靶基因（ABCA1、CPT1a等）表达。
   • Western blotting分析蛋白水平（ABCA1、CPT1a、COL1A1等）。
   • 肝脏脂质组学：采用Folch法提取脂质，酶比色法量化胆固醇和甘油三酯。
   • 组织学分析：H&E染色、Masson三色染色、天狼星红染色评估脂肪变性、炎症和纤维化。

3. 细胞实验

   • 人肝星状细胞系(LI90)培养：TGF-β刺激后检测miR-33b对纤维化标志物（COL1A1、ACTA2）的影响。
   • 转染实验：使用Lipofectamine 2000递送抗miR-33b AMO。

主要结果
1. miR-33b KI小鼠的NASH表型
- HFD喂养12周后，miR-33b KI小鼠出现典型NASH特征：肝脏胆固醇含量显著增加（p<0.01），甘油三酯上升趋势；ALT/AST水平升高（ALT：60.6 vs 26.2 IU/L，p<0.05）；组织学显示脂肪堆积、气球样变和纤维化（Masson染色证实）。 - 分子机制：靶基因ABCA1和CPT1a表达显著降低（蛋白水平下降50%，p<0.05），而炎症因子TNF和纤维化标志物COL1A1表达上调（2-3倍，p<0.01）。

1. 细胞特异性作用

   • 肝细胞特异性敲除miR-33b（Alb-Cre/miR-33bfl/fl KI）显著改善NASH：血清HDL-C升高（64.6 vs 38.8 mg/dL，p<0.01），肝脏纤维化面积减少60%（p<0.001）。
   • 巨噬细胞特异性敲除（LysM-Cre/miR-33bfl/fl KI）对NASH无显著影响，证实miR-33b主要在肝细胞中发挥作用。

2. AMO治疗效果

   • 抗miR-33b AMO在GAN饮食模型中表现最优：
     • 肝脏游离胆固醇(F-CHO)降低40%（p<0.01）
     • 纤维化面积减少70%（p<0.001）
     • NAS评分从6.9降至3.0（p<0.001）
   • 机制：上调ABCA1（2倍，p<0.01）促进胆固醇外排，同时抑制HSC中COL1A1和α-SMA表达（50%下降，p<0.05）。

结论与价值
本研究首次证实miR-33b在肝细胞中的关键作用：通过抑制ABCA1介导的胆固醇外排和CPT1a相关的脂肪酸氧化，导致脂毒性并促进NASH进展。开发的靶向miR-33b核酸药物能有效改善肝脏脂质代谢和纤维化，且无显著副作用。科学价值在于阐明了人类特异性miRNA在代谢疾病中的独特机制；临床应用价值为NASH治疗提供了新的核酸药物靶点。

研究亮点
1. 模型创新：首次构建miR-33b人源化KI小鼠，弥补了啮齿类动物缺乏该基因的研究空白。 2. 治疗突破：使用氨基桥接核酸(Amido-Bridged Nucleic Acid)技术开发能区分miR-33a/b（仅2碱基差异）的高特异性AMO。 3. 机制深度：揭示miR-33b通过”肝细胞自主性”机制调控NASH，与巨噬细胞中的miR-33a作用路径不同。 4. 转化意义：GAN饮食模型更接近人类NASH的严重表型，增强了临床预测价值。

其他发现
肝脏代谢组学显示miR-33b KI小鼠棕榈酸、硬脂酸等脂质成分异常积聚，提示这些代谢物可能参与炎症触发。体外实验证实TGF-β可诱导HSC中miR-33b表达，表明其可能通过旁分泌机制加剧纤维化。