本研究由向磊（Lei Xiang）、蔡相升（Xiangsheng Cai）、赵晓山（Xiaoshan Zhao）等多位研究者合作完成，主要研究机构包括暨南大学第一附属医院肾内科、南方医科大学中医药学院、中国科学院大学深圳医院肾内科等。该论文于2023年10月28日在线发表于Heliyon期刊（第9卷，文章编号e21714），由Elsevier Ltd.以开放获取（Open Access）形式出版，遵循CC BY许可协议。
糖尿病肾病（diabetic kidney disease, DKD）是糖尿病常见的微血管并发症之一，已成为全球终末期肾病（end-stage renal disease, ESRD）的主要原因，约有50%的DKD患者可能进展为ESRD。目前针对DKD的治疗手段尚不能完全有效阻断肾脏损伤的进展。中医药（traditional Chinese medicine, TCM）在延缓慢性肾脏病合并糖尿病患者肾功能下降、降低ESRD风险和死亡率方面显示出一定的优势。
芪丹地黄颗粒（Qidan Dihuang Granule, QDDHG）是在中医理论指导下组方的中药复方，由黄芪（Huangqi）、丹参（Danshen）、地黄（Dihuang）、山药（Shanyao）和甘草（Gancao）五味中药组成。多中心随机对照试验已证明QDDHG联合血管紧张素受体拮抗剂可显著降低DKD患者的白蛋白尿水平、改善中医证候评分并延缓疾病进程，但其具体作用机制尚不明确。本研究旨在利用网络药理学（network pharmacology）方法、超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）技术以及动物实验，系统揭示QDDHG治疗DKD的活性成分、潜在靶点和作用通路。
本研究共包含三大研究步骤：网络药理学分析、分子对接验证以及实验验证。
首先进行了QDDHG活性成分的筛选与靶点预测。研究者从TCMSP和ETCM数据库中检索QDDHG的活性成分，以口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%和类药性（drug-likeness, DL）≥0.18为筛选阈值，共鉴定出190个符合条件的活性化合物。其中黄芪含17个、丹参含59个、地黄含8个、山药含15个、甘草含91个活性成分。这些活性成分通过Uniprot数据库和Swiss Target Prediction数据库共对应到921个基因，去重后保留469个潜在靶基因。
其次，从DisGeNET、GeneCards、OMIM和DrugBank四个疾病数据库中检索DKD相关靶基因，以“DN”（diabetic nephropathy）或“DKD”（diabetic kidney disease）为检索词，共获得3872个DKD相关基因，其中GeneCards数据库贡献最多（3319个基因）。
将QDDHG的469个靶基因与DKD的3872个疾病基因取交集，获得275个潜在治疗靶点。利用Metascape平台进行蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction, PPI）富集分析，并通过Cytoscape 3.6.1软件构建PPI网络。以介数中心性（betweenness centrality, BC）≥0.016、紧密中心性（closeness centrality, CC）≥0.563、度值（degree）≥80（中位数的四倍）为拓扑筛选条件，最终获得包含13个核心靶点、71条边的核心靶点网络。
随后对275个交集靶点进行基因本体论（Gene Ontology, GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析。GO分析共返回3002个条目，包括2584个生物过程（biological process, BP）条目、155个细胞组分（cellular component, CC）条目和263个分子功能（molecular function, MF）条目。KEGG富集分析发现222条信号通路。
此外，研究者构建了“中药-活性成分-靶点-通路”网络，包含480个节点和2772条边。以BC≥0.00068、CC≥0.3731、度值≥20为筛选条件，从网络中筛选出18个核心活性化合物。
利用TCMNPAS在线分析平台的AutoDock Vina分子对接模块对18个核心活性化合物与13个核心靶蛋白进行分子对接验证。蛋白受体的PDB ID从RCSB蛋白数据库获得，结合能≤-5.0 kJ·mol⁻¹时认为活性成分与蛋白的结合具有可行性。对接结果显示235对分子对接组合具有可行的结合效果。
药物成分分析： QDDHG中药颗粒购自天江药业有限公司，采用Ultimate 3000液相色谱联用Q Exactive质谱系统进行UHPLC-MS/MS成分鉴定。按峰积分、保留时间、峰对齐、峰提取和峰面积进行数据处理。
动物实验设计： 采用8周龄雄性db/db小鼠（DKD模型）和db/m小鼠（正常对照），适应性饲养14天后随机分为四组：正常对照组（NC组，db/m小鼠）、DKD模型组（db/db小鼠）、QDDHG1组（db/db小鼠，饲料含1% QDDHG，即每1000g饲料含10g QDDHG）和QDDHG2组（db/db小鼠，饲料含2% QDDHG，即每1000g饲料含20g QDDHG）。治疗16周后处死小鼠，采集血液和肾组织样本。实验方案经中国科学院大学深圳医院伦理委员会批准（伦理号：LL-KT-2021231）。
生化指标检测： 血样以5000转/分离心10分钟分离血清，使用日立7600全自动生化分析仪检测血清肌酐（serum creatinine, SCr）和血尿素氮（blood urea nitrogen, BUN），采用ELISA试剂盒测定24小时尿白蛋白（albumin, ALB）水平。
肾脏组织学评估： 肾组织经4%多聚甲醛固定、石蜡包埋后，分别进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin, HE）染色、过碘酸雪夫（periodic acid-schiff, PAS）染色和Masson三色染色。使用NIS-Elements Viewer软件定量分析肾小球系膜区糖原沉积强度和胶原纤维强度。肾皮质经透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM）固定液处理后送武汉赛维尔生物科技有限公司进行超微结构检测。
免疫荧光染色： 肾组织切片经脱蜡、水化、抗原修复后，以3% BSA封闭非特异性结合，使用nephrin一抗（1:1000稀释）4°C孵育过夜，随后以Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG作为二抗，DAPI染核，使用尼康Eclipse C1荧光显微镜采集图像。
Western blot分析： 肾组织用RIPA缓冲液裂解，Bradford法定量蛋白，取50 ng蛋白进行SDS-PAGE电泳，转PVDF膜，5% BSA封闭后分别以抗EGFR、抗STAT3、抗β-actin（1:2000稀释）及抗ERK1/2、抗磷酸化ERK1/2（pERK1/2，1:5000稀释）抗体4°C孵育过夜，山羊抗兔IgG（1:5000稀释）孵育1小时后ECL显色，Tanon-5200成像并用Image J软件定量分析。
统计分析： 使用SPSS 19.0进行统计分析，采用ANOVA及Tukey事后检验或Tamhane’s T2检验，P值<0.05视为具有统计学差异。
核心靶点网络分析确定了13个QDDHG治疗DKD的核心靶蛋白，包括MAPK3、MAPK1、EGFR、MYC、JUN、TP53、HSP90AA1、RELA、SRC、MAPK14、STAT3、AKT1和PRKCA，其中MAPK3的度值最高（109），MAPK1紧随其后（108），EGFR和MYC各为101。
GO富集分析显示，生物学过程主要涉及激素响应（response to hormone）、氧化应激响应（response to oxidative stress）、细胞对脂质的响应（cellular response to lipid）、激酶活性调控（regulation of kinase activity）、MAPK级联调控以及生长因子响应等。KEGG通路富集表明QDDHG主要通过AGE-RAGE信号通路、PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药通路、HIF-1信号通路、VEGF信号通路、Rap1信号通路、NF-kappa B信号通路和JAK-STAT信号通路等发挥治疗作用。
“中药-活性成分-靶点-通路”网络分析筛选出18个核心活性化合物，包括槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、7-异喹啉醇（7-isoquinolinol）、阿魏酸甲酯（ferulic acid methyl ester）、异鼠李素（isorhamnetin）、芒柄花素（formononetin）、木犀草素（luteolin）、地黄甙元（rehmapicrogenin）、毛蕊异黄酮（calycosin）、柚皮素（naringenin）、丹参酮IIA（tanshinone IIA）、3′,7-二羟基-4′,6-二甲氧基异黄酮、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、松属素（pinocembrin）、7-O-甲基异甘草素、甘草查尔酮A（licochalcone A）、熊竹素（jaranol）和二氢丹参内酯（dihydrotanshinlactone）。其中槲皮素的度值最高（232），是网络中最核心的活性成分。
分子对接结果显示235对化合物-蛋白组合具有可行的结合效果。结合亲和力分析表明丹参酮IIA与PRKCA、AKT1、STAT3、RELA、TP53、HSP90AA1、JUN、MAPK1和MAPK3等多个靶蛋白均表现出显著的最低结合能；芒柄花素与MAPK14、二氢丹参内酯与SRC和EGFR、松属素与HSP90AA1、槲皮素与MYC也表现出较强的结合亲和力。
UHPLC-MS/MS分析共检测到QDDHG中16种化学成分，其中6种为网络药理学预测的核心活性成分，包括毛蕊异黄酮（calycosin）、7-异喹啉醇（7-isoquinolinol）、柚皮素（naringenin）、松属素（pinocembrin）、芒柄花素（formononetin）和3′,7-二羟基-4′,6-二甲氧基异黄酮（odoratin）。这一结果部分验证了网络药理学的预测。
生化指标改善： 治疗16周后，QDDHG1组小鼠的SCr和BUN较DKD组显著降低；QDDHG2组小鼠的24小时尿白蛋白、SCr和BUN水平均较DKD组显著降低。QDDHG2组小鼠体重较DKD组呈现渐进性增加趋势，空腹血糖在QDDHG1和QDDHG2组均有所下降。
肾脏病理改善： HE染色显示db/db小鼠肾小球出现系膜基质增生、内皮细胞和系膜细胞数量减少及结节性硬化等病变，QDDHG1和QDDHG2治疗均能改善上述肾小球病理改变。PAS染色定量分析显示QDDHG1和QDDHG2组小鼠肾小球糖原沉积强度显著低于DKD组。Masson染色显示QDDHG2组肾小球胶原累积明显减少。TEM超微结构观察显示NC组足突排列紧密、滤过裂隙狭窄；DKD组足突间隙增宽、出现足突融合和裂隙渗漏，肾小球基底膜（glomerular basement membrane, GBM）增厚；QDDHG1和QDDHG2治疗组上述超微结构损伤明显减轻。
足细胞标志蛋白恢复： 免疫荧光检测显示DKD组肾小球nephrin蛋白表达较NC组显著下调，QDDHG1和QDDHG2组nephrin表达较DKD组明显上调，表明QDDHG能够部分恢复足细胞nephrin表达。
蛋白表达调控： Western blot结果显示DKD组肾组织中EGFR、STAT3和pERK1/2蛋白表达较NC组显著上调；QDDHG1和QDDHG2治疗后，EGFR、STAT3和pERK1/2蛋白表达均较DKD组显著下降。这一结果与网络药理学预测的靶点和通路高度一致，证实QDDHG主要通过抑制EGFR、STAT3和ERK1/2的磷酸化活性来发挥肾脏保护作用。
本研究首次揭示了QDDHG治疗DKD的作用机制：QDDHG主要通过抑制EGFR、STAT3和磷酸化ERK（pERK）的表达，调节氧化应激、脂质代谢等多条生物学过程和AGE-RAGE、MAPK、PI3K-AKT等多条信号通路，从而减少白蛋白尿、保护肾功能、减轻肾小球病理损伤并维持足细胞完整性。
该研究的科学价值在于：综合运用网络药理学预测、分子对接验证和体内动物实验验证的多层次研究策略，系统阐释了中药复方QDDHG“多成分-多靶点-多通路”的复杂作用网络。应用价值在于：为QDDHG的临床合理应用提供了实验依据，也为中药复方作用机制研究提供了可借鉴的方法学范式。此外，该研究鉴定出的多个活性成分对DKD的作用尚缺乏文献报道，为后续深入研究指明了方向。
本研究的突出亮点包括：第一，采用网络药理学与UHPLC-MS/MS成分鉴定相结合的方法，实现了“预测-验证”的闭环研究逻辑，增强了研究结论的可靠性；第二，首次在体内实验中证实QDDHG通过调控EGFR/STAT3/ERK信号轴发挥抗DKD作用；第三，筛选出多个潜在活性成分在DKD治疗中的可能作用，为中药单体研究提供了新线索；第四，以db/db小鼠作为2型糖尿病肾病模型，具有较好的临床相关性。
该研究未对单一药物或单体成分进行体内外验证，主要基于中药复方多成分协同作用的考虑；此外，KEGG富集分析提示的其他潜在活性化合物和信号通路尚需更多实验加以阐明。