关于青葙苷I通过ROS介导NF-κB p65/NLRP3/Caspase-1信号通路抑制视神经损伤模型视网膜神经节细胞焦亡机制研究的学术报告

本研究由韩易言（辽宁中医药大学、辽宁省针灸养生康复重点实验室）、左韬（辽宁中医药大学、辽宁中医药大学附属第二医院）、赵磊（辽宁中医药大学附属第二医院）、宁志豪（辽宁中医药大学）、董宝强（辽宁中医药大学、辽宁省针灸养生康复重点实验室）、郑曲（辽宁中医药大学、辽宁省针灸养生康复重点实验室）共同完成，发表于学术期刊 traditional chinese drug research & clinical pharmacology 2026年5月第37卷第5期。

一、 学术背景

本研究属于神经科学、眼科学与中药药理学交叉领域，聚焦于视神经损伤（Optic Nerve Injury， ONI）这一临床常见且治疗棘手的疾病。视神经损伤可由外伤、青光眼、肿瘤压迫等多种原因引起，导致视网膜神经节细胞（Retinal Ganglion Cells， RGCs）的不可逆性死亡，进而引发视力下降、视野缺损乃至永久性失明，给患者和社会带来沉重负担。因此，探寻能够有效保护RGCs、延缓或阻止视神经损伤进展的治疗策略至关重要。

近年来，细胞焦亡（Pyroptosis）作为一种新发现的、由Gasdermin家族蛋白介导的程序性细胞死亡方式，在神经系统损伤性疾病中的作用日益受到关注。不同于凋亡，细胞焦亡伴随着细胞肿胀、膜孔形成、内容物释放和强烈的炎症反应，可能加剧继发性神经损伤。研究表明，在视神经损伤中，细胞焦亡可能是导致RGCs死亡的重要途径之一。其经典激活通路涉及活性氧（Reactive Oxygen Species， ROS）的积累，进而激活核因子κB（Nuclear Factor-κB， NF-κB）信号，上调NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体的表达，活化的NLRP3炎症小体进一步激活胱天蛋白酶-1（Caspase-1），活化的Caspase-1剪切Gasdermin D（GSDMD）蛋白，使其N端片段在细胞膜上成孔，最终导致细胞焦亡。

青葙子是中医眼科常用药，具有清肝明目的功效。青葙苷I（Celosin I）是从青葙子中提取的标志性活性单体成分，前期研究提示其具有抗氧化、抗炎等多种药理活性。然而，青葙苷I是否能够通过干预ROS/NLRP3/Caspase-1介导的细胞焦亡通路来保护视神经损伤中的RGCs，其具体机制尚不明确。

基于以上背景，本研究旨在探讨青葙苷I是否通过抑制ROS的产生，进而调控NF-κB p65/NLRP3/Caspase-1信号通路，从而抑制视神经损伤模型中RGCs的焦亡，为青葙苷I治疗视神经损伤提供新的实验依据和分子机制解释。

二、 详细研究流程

本研究是一项严谨的动物实验，其工作流程系统且环环相扣，主要包含以下几个关键步骤：

1. 实验动物分组与模型建立：研究选用24只SPF级健康雄性新西兰大白兔，随机分为4组，每组6只：假手术组（仅切开球结膜后缝合）、模型组（建立视神经损伤模型）、甲钴胺组（模型+甲钴胺治疗）和青葙苷I组（模型+青葙苷I治疗）。视神经损伤模型的建立方法是在麻醉下，于兔眼颞上象限暴露视神经，使用特制显微镊在球后2 mm处夹持视神经10秒（力度0.5 N）。模型成功标准为术后第3天出现直接对光反射消失、瞳孔持续散大。

2. 药物干预：模型复制成功后开始给药，连续28天。假手术组和模型组给予等体积双蒸水灌胃；甲钴胺组给予0.15 mg·kg⁻¹甲钴胺溶液灌胃（阳性对照药物）；青葙苷I组给予30 mg·kg⁻¹青葙苷I混悬液（溶于0.5%羧甲基纤维素钠）灌胃。该剂量基于前期预实验确定。

3. 样本采集与处理：末次给药后，通过耳鼻喉内窥镜观察各组眼底情况并记录。随后处死动物，摘取眼球及部分视神经组织。一部分组织用多聚甲醛固定用于形态学和免疫荧光检测，另一部分迅速冻存于-80°C用于蛋白提取。

4. 多层次指标检测与分析：这是本研究的核心部分，从宏观到微观，从形态到分子，进行了系统评估。

   • 形态学观察：采用苏木精-伊红（HE）染色法，在光学显微镜下观察各组视网膜的整体结构，特别是RGCs层的排列、细胞形态和数量变化。
   • 细胞死亡检测：采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）检测视网膜组织中细胞凋亡情况，计算凋亡指数。虽然TUNEL主要标记DNA断裂（凋亡标志），但在焦亡晚期也可能呈阳性，可作为细胞死亡的一个总体指标。
   • 分子表达定位与半定量：采用免疫荧光（IF）法，在荧光显微镜下观察并定量分析视网膜组织中ROS、NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1蛋白的荧光表达强度和定位情况。
   • 蛋白表达水平定量：采用蛋白质免疫印迹法（Western Blot），检测视网膜组织中ROS、NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1以及焦亡执行蛋白GSDMD的表达水平，以β-肌动蛋白（β-actin）作为内参进行标准化。
   • 超微结构观察：采用透视电子显微镜（TEM）直接观察视网膜神经节细胞中焦亡小体的数量，这是证明细胞发生焦亡的最直接形态学证据之一。判定标准包括可见焦亡小体、细胞肿胀破裂、质膜孔洞和线粒体水肿。

5. 数据分析：所有定量数据以均数±标准差表示。使用SPSS 25.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析及Tukey事后检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

三、 主要研究结果

研究结果层层递进，有力地支持了青葙苷I通过抑制ROS/NLRP3/Caspase-1通路减轻RGCs焦亡的假设。

1. 青葙苷I改善视神经损伤后的眼底和视网膜形态：内窥镜观察显示，模型组眼底视盘边缘模糊、色泽灰白，提示血供不良；而青葙苷I组眼底情况明显改善，接近假手术组。HE染色结果显示，模型组RGCs数量减少、排列紊乱、核固缩；甲钴胺组有所改善但仍存异常；青葙苷I组RGCs排列有序，形态接近正常。这表明青葙苷I能有效减轻视神经损伤后的组织病理学改变。

2. 青葙苷I减少视网膜细胞死亡：TUNEL检测显示，模型组的视网膜细胞凋亡指数显著高于假手术组。与模型组相比，甲钴胺组和青葙苷I组的凋亡指数均显著降低，且青葙苷I组的降低效果显著优于甲钴胺组。这初步证明青葙苷I在减少视神经损伤后细胞死亡方面具有优于常规营养神经药物（甲钴胺）的效果。

3. 青葙苷I抑制ROS/NLRP3/Caspase-1信号通路关键分子的表达：

   • 免疫荧光结果：模型组视网膜组织中ROS、NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1的荧光强度均显著高于假手术组，表明损伤激活了该通路。经青葙苷I治疗后，这些蛋白的荧光表达均被显著抑制，且抑制效果优于甲钴胺组。
   • Western Blot结果：与免疫荧光结果一致，模型组ROS、NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1以及下游的GSDMD蛋白表达水平均显著上调。青葙苷I治疗能显著逆转这种上调，将各蛋白表达水平降低至接近甚至低于甲钴胺组的水平。特别是GSDMD蛋白表达的下降，直接提示焦亡执行环节被抑制。

4. 青葙苷I直接减少细胞焦亡的发生：透射电镜结果提供了最直接的证据。在模型组的RGCs中，可观察到典型的焦亡小体，数量显著多于假手术组。而青葙苷I治疗后，焦亡小体的数量显著减少，效果同样优于甲钴胺组。这从超微结构层面证实，青葙苷I确实能有效抑制视神经损伤后RGCs的焦亡过程。

结果间的逻辑关系：首先，形态学（HE染色）和细胞死亡（TUNEL）结果证明了青葙苷I的保护效应。接着，分子水平检测（IF和WB）揭示了这种保护作用与抑制ROS/NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路密切相关。最后，电镜观察到的焦亡小体减少，将分子通路的抑制与最终的细胞死亡表型（焦亡）直接联系起来，形成了“药物干预→抑制关键信号分子→减少特征性细胞死亡形态”的完整证据链。

四、 研究结论

本研究得出结论：青葙苷I能够通过抑制活性氧（ROS）的产生，进而抑制NF-κB p65/NLRP3/Caspase-1信号通路的激活，减少焦孔素D（GSDMD）的剪切和释放，从而有效减少视神经损伤模型中视网膜神经节细胞（RGCs）的焦亡，减轻视神经损伤，延缓视力损失。

五、 研究的意义与价值

• 科学价值：

  1. 机制创新：首次系统阐明了青葙苷I对视神经损伤的保护作用与抑制细胞焦亡密切相关，并将作用机制具体定位到ROS介导的NF-κB p65/NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路上，为理解中药单体成分治疗神经损伤提供了新的分子病理学视角。
  2. 靶点验证：证实了在视神经损伤中，ROS/NLRP3/Caspase-1介导的焦亡通路是RGCs死亡的重要机制，这为开发针对该通路的神经保护药物提供了明确的靶点。
  3. 中西医结合范例：将传统中药青葙子的活性成分与现代细胞死亡研究前沿（焦亡）相结合，是用现代科学语言阐释中药疗效机制的典范。

• 应用价值：

  1. 药物研发潜力：青葙苷I作为一种天然产物单体，显示出优于临床常用神经营养药物甲钴胺的保护效果，具有开发成为新型视神经保护药物的潜力。
  2. 治疗策略启示：研究提示，针对细胞焦亡通路（尤其是上游的ROS和炎症信号）进行干预，可能是治疗视神经损伤、青光眼等视网膜神经退行性疾病的有效策略。

六、 研究亮点

1. 研究视角新颖：聚焦于细胞焦亡这一相对较新的程序性细胞死亡方式在视神经损伤中的作用，选题具有前沿性。
2. 证据链条完整：研究设计严谨，从整体动物行为（眼底）、组织形态（HE）、细胞死亡（TUNEL）、蛋白表达（IF、WB）到超微结构（TEM），构建了多层次、多角度的完整证据体系，结论可信度高。
3. 对照设置合理：不仅设置了假手术组和模型组，还设置了阳性药物（甲钴胺）对照组，清晰展示了青葙苷I相对于现有治疗药物的优势。
4. 机制探讨深入：不仅观察了表型，还深入探讨了从ROS到NF-κB，再到NLRP3炎症小体激活、Caspase-1剪切GSDMD直至最终焦亡的完整信号轴，机制阐述清晰。

七、 其他有价值的内容

研究在讨论部分还提出了青葙苷I可能存在的“多靶点优势”，即其可能同时调控ROS生成、NF-κB活化和NLRP3组装等多个环节，这或许是其疗效优于单靶点药物甲钴胺的原因。同时，作者也客观指出了本研究的局限性，如样本量较小、未检测焦亡相关的炎性细胞因子（如IL-1β、IL-18）水平、仅使用雄性动物等，为后续研究指明了方向。此外，文中提及青葙苷I的血视网膜屏障透过性已在其他模型中得到验证，且本研究剂量下未观察到明显毒性，为其临床转化提供了一定的安全性依据。