近日，由王庆、杨蕊、曾洁、余泓鹏、陆守一、梁馨云、林华胜、张薇、金敏、李璐及赵祖国等研究人员共同完成的一项关于高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumoniae, hvKP）的研究，正式发表于《journal of guangdong medical university》（广东医科大学学报）2026年2月出版的第44卷第1期。该研究题为《高毒力肺炎克雷伯菌 wzc 基因敲除株的构建及其生物学特性分析》，聚焦于hvKP的关键毒力因子——荚膜多糖的合成调控机制。
研究背景与目的
肺炎克雷伯菌是院内感染的重要条件致病菌，其中高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP）因其强大的致病性和高致死率而备受关注。与普通肺炎克雷伯菌（ckp）不同，hvKP能引起严重的社区获得性和院内感染，如肝脓肿、脑膜炎等。其强大的毒力与多种因素有关，其中荚膜是关键毒力因子之一。荚膜由荚膜多糖（capsular polysaccharide, CPS）构成，在细菌表面形成保护层，帮助其逃逸宿主免疫系统的清除。
荚膜多糖的合成与转运由染色体上的cps基因簇协同调控。wzc基因是该基因簇中的重要成员，其编码的Wzc蛋白是一种酪氨酸磷酸自激酶。已有研究表明，Wzc通过与外膜蛋白Wza、磷酸酶Wzb相互作用，通过自身的磷酸化与去磷酸化循环，调控CPS链的延长与输出，从而影响荚膜的厚度和粘稠度。然而，wzc基因在特定高毒力、超高粘液表型菌株中的具体功能，仍需深入探索。
本研究的出发点源于实验室保存的一株具有极端粘液表型的hvKP临床分离株KPN234。该菌株拉丝试验阳性，且拉丝长度可达惊人的50厘米，这种超高粘液性在已有文献中未见报道。鉴于wzc在决定荚膜多糖链长中的核心作用，研究团队推测该菌株的独特表型可能与wzc基因的特性有关。因此，本研究的主要目的包括：1）成功构建hvKP KPN234菌株的wzc基因敲除株；2）系统评估wzc基因缺失对细菌生长、荚膜合成能力及体内毒力的影响；3）为深入阐明wzc基因在hvKP致病机制中的作用奠定基础。
详细研究流程与方法
本研究是一项系统性的基因功能研究，主要流程可分为五个核心环节：基因敲除株的构建与验证、生长特性分析、荚膜合成表型检测、体内毒力评估以及数据处理。
第一环节：wzc基因敲除株的构建与多重验证。 研究以hvKP KPN234野生株为研究对象。首先，研究团队利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行基因敲除。具体步骤包括：1）设计并构建敲除载体：在CRISPR设计网站输入wzc基因序列，针对肺炎克雷伯菌选定最优的引导RNA（sgRNA，序列：GCGGTTTGAGCAAAGTGGTG）。将该sgRNA克隆至携带卡那霉素抗性基因和蔗糖致死基因（sacB）的sgRNA表达载体psgkp-km中，形成psgkp-km-sgrNA。接着，通过PCR扩增wzc基因开放阅读框上游各500 bp的DNA序列作为同源修复模板，并将其插入到上述载体的特定酶切位点，最终构建成完整的基因敲除重组质粒psgkp-km-wzc-sgrNA。2）电转与筛选：将表达Cas9蛋白的温度敏感型质粒pcaskp-ap先电转入KPN234，获得含Cas9的工程菌。再将构建好的psgkp-km-wzc-sgrNA质粒电转入该工程菌。通过含有安普霉素和卡那霉素的双抗平板在30°C下进行筛选，获得可能发生基因编辑的克隆。3）质粒消除：为消除外源质粒对后续实验的干扰，将初步筛选的阳性克隆在含有20%蔗糖的LB培养基中37°C连续培养三代。高浓度蔗糖会诱导sacB基因表达产生毒性物质，从而杀死仍携带psgkp-km质粒的细菌，而成功丢失该质粒的细菌得以存活。同时，pcaskp-ap是温度敏感型质粒，在37°C下无法复制，也会随之丢失。4）多层次验证：对最终获得的候选菌株进行 rigorous 验证。基因水平：使用针对wzc基因内部和跨区域的引物进行PCR鉴定。结果显示，与野生株能扩增出预期条带不同，敲除株用内部引物无法扩增出产物，用跨区域引物扩增出的条带显著变小，初步证明wzc基因序列缺失。基因组水平：对野生株和敲除株进行全基因组测序，并使用breseq软件进行比对分析。结果确认敲除株仅缺失了长达2172 bp的wzc基因（编码多糖生物合成酪氨酸自激酶），未发现其他位点的突变，证明敲除成功且无脱靶效应。蛋白水平：通过Western Blot检测Wzc蛋白的表达。结果显示，野生株总蛋白中存在与Wzc抗体结合的特异性条带，而敲除株在相应位置无此条带，从蛋白质表达层面证实了wzc基因的功能性敲除。最终获得的敲除株被命名为KPN234△wzc。
第二环节：生长曲线测定。 为评估wzc基因缺失是否影响细菌的基本生理功能，研究比较了KPN234野生株与KPN234△wzc的生长情况。将两株菌的过夜培养物调整至相同吸光度（A600）后，以1:100比例接种至新鲜LB培养基，于37°C震荡培养。每隔2小时取样，用酶标仪测定A600值，连续监测24小时，绘制生长曲线。实验重复三次。
第三环节：荚膜相关表型检测。 此环节旨在定量和半定量评估wzc基因对荚膜合成的影响，包含三项实验。1）拉丝试验（String Test）：这是一种直观的初筛方法。用接种环从血平板上挑起单个菌落，观察能否拉出丝状物。拉丝长度大于5 mm即判定为高粘液表型阳性。2）粘度半定量试验：将两株菌的过夜培养液调整至A600约为1.0，取1 ml于离心管中，以1000 rpm低速离心5分钟。低速离心后，粘液性强的细菌不易沉淀，上清液仍较浑浊；反之则沉淀紧实，上清澄清。小心吸取200 μl上清液，测定其A600值，该值可间接反映菌液粘度。3）荚膜多糖定量检测：荚膜多糖的主要成分之一是糖醛酸。本研究通过测定糖醛酸含量来间接量化荚膜多糖。以葡萄糖醛酸内酯为标准品制作标准曲线。收集对数生长期的细菌，通过热水酚法提取荚膜相关物质，再利用间羟基联苯显色法测定提取物中的糖醛酸含量，最后根据标准曲线计算每单位菌量（以A600=1.0的菌液为基准）对应的糖醛酸量（微克）。
第四环节：体内毒力评估——大蜡螟幼虫感染模型。 为探究wzc基因缺失对细菌整体毒力的影响，研究采用了替代哺乳动物的感染模型——大蜡螟幼虫。将体重约300 mg的健康幼虫随机分组，每组30只。将KPN234野生株和KPN234△wzc培养至对数期，用PBS洗涤并重悬，调整菌液浓度。使用微量注射器将10 μl菌悬液（约含10^6 CFU）注射入幼虫倒数第二体节的左淋巴腔内。设立不注射任何物质的空白对照组和仅注射PBS的溶剂对照组。注射后，将所有幼虫置于37°C培养，每隔12小时观察并记录存活幼虫数量，持续72小时，并绘制生存曲线。
第五环节：数据处理。 所有计量资料以均值±标准差表示。生长曲线、粘度半定量、荚膜多糖定量数据的组间比较采用两独立样本t检验。大蜡螟幼虫生存曲线数据采用Log-rank检验进行比较。统计分析均使用GraphPad Prism 9软件完成，以P < 0.05为差异具有统计学意义。
主要研究结果与分析
研究获得了一系列明确且相互印证的实验结果，系统地揭示了wzc基因在KPN234菌株中的功能。
在基因敲除验证方面，PCR、全基因组测序和Western Blot的结果高度一致，确凿地证明了KPN234△wzc菌株中wzc基因被成功、特异性地敲除，且不再表达Wzc蛋白。这为后续所有表型比较提供了可靠的前提。
生长曲线结果显示，与野生株相比，KPN234△wzc的生长速度更快（P < 0.01），但两者进入对数期和平台期的时间点相近。这表明wzc基因的缺失并未抑制细菌生长，反而可能由于荚膜合成负担的减轻，使细菌能将更多资源用于增殖，这与一些关于荚膜合成相关基因敲除后细菌生长加速的报道相符。
荚膜合成相关表型检测结果 发生了显著变化。首先，拉丝试验发生了根本性转变：野生株KPN234表现出典型的高粘液表型，可拉出长丝；而KPN234△wzc完全丧失了拉丝能力，菌落干燥。其次，粘度半定量试验中，KPN234△wzc经低速离心后沉淀更为紧实，其上清液的A600值显著低于野生株上清液（P < 0.001），定量证实了其粘度的急剧下降。最后，荚膜多糖定量检测 给出了最直接的证据：KPN234△wzc的糖醛酸含量（即荚膜多糖含量）相较于野生株显著降低（P < 0.001）。这三项实验从定性到定量，层层递进，共同有力地证明：wzc基因的敲除，导致了KPN234菌株荚膜多糖合成能力的大幅削弱，从而使其丧失了高粘液表型。这直接印证了wzc在正向调控荚膜合成中的关键作用。
体内毒力实验的结果 将表型变化与致病性直接联系起来。在72小时的观察期内，空白对照组和PBS对照组的幼虫存活率为100%。接种了KPN234野生株的幼虫，死亡率达到47%。而接种了KPN234△wzc的幼虫，死亡率仅为7%，其生存曲线与野生株组存在极显著差异（P < 0.001）。这一结果清晰地表明，wzc基因的缺失，使得细菌对宿主的致病力（毒力）急剧下降。由于荚膜是hvKP抵抗宿主吞噬细胞吞噬的主要屏障，wzc敲除导致的荚膜缺陷，无疑是其毒力减弱的核心原因。体内外实验结果形成了完整的逻辑链条：wzc缺失 → 荚膜合成减少 → 粘液表型丧失 → 体内毒力降低。
研究结论与价值
本研究成功利用CRISPR/Cas9技术构建了高毒力肺炎克雷伯菌KPN234的wzc基因敲除株KPN234△wzc。通过系统的生物学特性分析，得出明确结论：wzc基因对hvKP KPN234菌株的荚膜多糖合成起着至关重要的正向调控作用，其缺失会导致细菌荚膜产量显著减少，高粘液表型消失，并最终导致其体内毒力大幅衰减。
该研究的科学价值在于：1）基因功能验证：在具有极端粘液表型的特殊临床菌株背景下，直接证实了wzc基因在荚膜合成和毒力决定中的核心功能，丰富了对于hvKP致病分子机制的理解。2）技术应用与优化：成功将CRISPR/Cas9双质粒系统应用于hvKP的基因编辑，并针对该菌株优化了实验条件（如使用20%高浓度蔗糖进行质粒消除），为后续针对hvKP的其他基因功能研究提供了可靠的技术方案和参考。3）研究模型建立：构建的wzc基因敲除株本身就是一个有价值的研究工具，为进一步深入探索wzc蛋白的调控网络、与其他毒力因子的互作，乃至荚膜合成的详细分子机制奠定了坚实的基础。
从应用潜力来看，wzc作为荚膜合成的关键调控因子，是潜在的抗感染药物靶点。针对Wzc蛋白或其调控通路开发抑制剂，有可能干扰hvKP荚膜的形成，从而“剥去”其保护外衣，使其更容易被宿主免疫系统或抗生素清除。本研究为评估这一策略的可行性提供了重要的前期实验依据。
研究亮点与特色
本研究的亮点突出体现在以下几个方面：
- 研究对象的独特性：研究的出发点是实验室保存的一株具有“拉丝长度达50厘米”极端高粘液表型的hvKP临床菌株KPN234。对如此特殊表型菌株的关键基因进行功能解析，本身就具有显著的探索价值和新颖性。
- 严谨的多层次验证体系：在基因敲除环节，没有仅仅依赖PCR初步鉴定，而是结合了全基因组测序和Western Blot，从DNA序列到蛋白质表达进行了三重验证，确保了基因敲除的成功性和特异性，结论非常可靠。
- 系统完整的表型分析链路：研究设计环环相扣，从基础的生长特性，到关键的荚膜合成表型（拉丝、粘度、定量），再到最终的体内毒力评估，形成了一条完整的功能分析链路，全面、有力地阐述了wzc基因的生物学功能。
- 实验技术的有效应用与优化：成功将前沿的CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于hvKP，并针对该菌株的特性（如对蔗糖耐受性可能较高）优化了质粒消除条件，体现了研究团队在方法学上的探索和实践能力。
其他有价值的信息
研究在讨论部分提及，通过NCBI比对发现KPN234的Wzc氨基酸序列与数据库中已有菌株的最高相似度仅为99.86%，未发现完全相同的序列，提示该菌株的wzc基因可能具有独特性。这或许与其极端粘液表型有关，为未来进行深入的比较基因组学或蛋白结构功能研究提供了线索。此外，作者也客观指出了本研究的局限性，即目前仅针对一株菌进行了分析，未来需要扩大菌株范围，以验证wzc基因功能在不同hvKP菌株中的普适性，并进一步探索其作为药物靶点的潜力。这些思考展现了研究的深度和前瞻性。