该研究报告发表于《中国免疫学杂志》（Chinese Journal of Immunology），其网络首发日期为2026年1月16日。这项研究由来自多家机构的科研人员共同完成，主要包括：广州医科大学附属中医医院肾病风湿科的蔡理（第一作者）、刘书源、赵威、李季、章平衡；南方医科大学第一临床医学院的肖兵；以及南京中医药大学第一临床医学院的张凯（通信作者）。
本研究属于中医现代化和自身免疫性疾病机制研究交叉的领域。类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）是一种常见的自身免疫性疾病，临床现有药物常存在耐药、副作用等问题。中医药在治疗RA，特别是特定证型如“湿热痹阻证”方面显示出良好疗效，但具体作用机制常不明确，限制了其现代化和国际认可。白虎加桂（枝）汤（Baihu-Guizhi Decoction, BHGZD）是治疗热痹的经典方剂，临床研究表明其对湿热痹阻型RA疗效确切。近年来，Nod样受体蛋白3（Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain-containing 3, NLRP3）炎性小体（inflammasome）的过度活化被认为是RA炎症反应的关键机制之一。沉默信息调节因子1（Sirtuin 1, SIRT1）作为一种去乙酰化酶，已被报道可负向调控NLRP3炎性小体的活化。然而，白虎加桂汤是否通过调控SIRT1-NLRP3轴来发挥治疗作用尚不清楚。因此，本研究旨在结合转录组学和网络药理学等现代技术，深入探讨白虎加桂汤治疗湿热痹阻证RA的具体分子机制，特别是其与SIRT1和NLRP3炎性小体活化的关系。
本研究设计严谨，流程复杂，综合运用了体内动物实验、体外细胞实验以及生物信息学分析等多种手段，主要包含以下几个详细步骤：
第一，动物模型构建与体内药效评价。研究使用7-8周龄雄性DBA/1J小鼠，首先通过尾根部皮内注射牛Ⅱ型胶原蛋白与完全弗氏佐剂的乳化液，建立了经典的胶原诱导型关节炎（Collagen-Induced Arthritis, CIA）模型。在此基础上，为了模拟中医“湿热痹阻”的证候特点，研究创新性地采用了“病证结合”的建模思路。在CIA造模的同时，将小鼠置于人工气候箱中接受湿热环境刺激（温度38℃，湿度100%，每日2小时，连续14天），从而构建了湿热痹阻证关节炎（SRBZZ）模型。这一模型旨在将西医的疾病病理与中医的证候特征相结合，更贴近临床实际情况。小鼠被随机分为六组：空白对照组（Ctrl）、CIA模型组、SRBZZ模型组，以及低、中、高三个剂量的白虎加桂汤干预组（分别给予0.5、1.0、2.0 g/100g体重的药物，其中中剂量相当于人临床等效剂量）。自初次免疫后第28天起开始灌胃给药，持续两周。药效评价指标全面，包括：每三天记录一次体重和关节炎指数评分；在实验终点，使用红外测温仪测量踝关节表面温度，使用足趾容积测定仪计算关节肿胀率；采集全血检测血沉（ESR），分离血清通过酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）检测C反应蛋白（CRP）及促炎细胞因子（TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-18）的水平；处死小鼠后取踝关节组织，进行苏木精-伊红（H&E）染色观察滑膜增生和炎症浸润情况，进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色评估破骨细胞活性和骨破坏程度。
第二，网络药理学分析与转录组测序（RNA-Seq）初步探索机制。为了从系统层面预测白虎加桂汤治疗RA的潜在靶点和通路，研究进行了网络药理学分析。研究人员从TCMSP数据库筛选出白虎加桂汤方剂中五味药材的活性成分及其靶点，同时从GeneCards、OMIM等疾病数据库中获取RA相关靶点。将两者取交集，得到120个药物-疾病共同作用靶点。通过构建蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）网络，发现IL-1β、NLRP3、IL-6、TNF等靶点处于网络核心。进一步的基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析显示，这些靶点显著富集于炎症反应、细胞凋亡以及NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路等，其中NLRP3炎性小体通路被确定为后续深入研究的重点方向。为验证网络药理学的预测，并更全面地揭示药物作用的基因表达变化，研究对SRBZZ模型组和BHGZD治疗组小鼠的踝关节组织进行了转录组测序（RNA-Seq）。生物信息学分析筛选出两组间的差异表达基因，并通过GO和KEGG富集分析发现，差异基因同样显著富集于“炎症反应”及“NLRP3炎性小体复合物”等相关条目，且NLRP3、ASC（PYCARD）、Caspase-1（CASP1）和IL-1β（IL1B）的mRNA表达在治疗组中显著下调。这为白虎加桂汤通过抑制NLRP3炎性小体通路发挥作用提供了强有力的基因组学证据。
第三，分子生物学实验验证关键靶点。基于上述预测和测序结果，研究通过更具体的分子实验进行验证。首先，使用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）检测了小鼠踝关节组织中NLRP3炎性小体关键组分（NLRP3, ASC, Caspase-1, IL-1β）的mRNA表达水平，结果证实BHGZD治疗能显著下调这些基因的表达。其次，为了深入探讨其细胞分子机制，研究构建了体外炎症模型。使用小鼠RAW264.7巨噬细胞，先用脂多糖（LPS）刺激，再用三磷酸腺苷（ATP）处理，成功激活了NLRP3炎性小体。在此模型上，用不同浓度的BHGZD进行干预。通过蛋白质免疫印迹（Western Blot）实验发现，BHGZD能以剂量依赖的方式降低LPS+ATP诱导的NLRP3、ASC、pro-Caspase-1的活化形式（cleaved Caspase-1）以及成熟的IL-1β（cleaved IL-1β）的蛋白表达水平，直接证明了药物对NLRP3炎性小体组装及活化的抑制作用。
第四，机制深入探究：SIRT1/NLRP3乙酰化轴的调控。研究进一步探索了白虎加桂汤抑制NLRP3活化的上游机制。已知NLRP3的乙酰化是其激活的重要标志，而SIRT1是主要的去乙酰化酶之一。Western Blot结果显示，在LPS+ATP诱导的巨噬细胞中，乙酰化NLRP3（ac-NLRP3）水平升高，而SIRT1表达下降。给予BHGZD干预后，能剂量依赖地上调SIRT1的表达，同时下调ac-NLRP3的水平。为了确认SIRT1在此通路中的关键作用，研究使用了SIRT1特异性抑制剂EX-527。结果发现，EX-527能够显著逆转BHGZD对SIRT1的上调作用以及对ac-NLRP3和总NLRP3的抑制作用。这一“挽救实验”有力地证明了BHGZD是通过上调SIRT1来实现对NLRP3去乙酰化和活化的抑制。最后，通过小鼠踝关节组织的免疫荧光染色，在体内水平再次验证了这一机制：CIA模型小鼠滑膜组织中NLRP3表达增高而SIRT1表达降低，经BHGZD治疗后，NLRP3表达减少，SIRT1表达回升，且呈剂量依赖性。
本研究所获得的主要结果层层递进，逻辑严密。在体药效学结果（第一部分）首先确认了白虎加桂汤能有效改善湿热痹阻证RA小鼠的关节肿胀、炎症评分、全身及局部炎症因子水平，并减轻滑膜增生和骨破坏，为其治疗有效性提供了坚实基础。网络药理学和RNA-Seq结果（第二部分）像“地图”一样，从海量数据中筛选并预测出NLRP3炎性小体通路是BHGZD潜在的核心作用靶点，将研究方向从宏观药效聚焦到具体信号通路。随后的RT-PCR和体外Western Blot结果（第三部分）则如同“确认地点”，用经典的分子生物学方法证实了药物确实能够抑制该通路关键分子的基因和蛋白表达。最后，围绕SIRT1和NLRP3乙酰化的深入研究（第四部分）则揭示了药物作用的“分子开关”——即通过上调SIRT1，促进NLRP3的去乙酰化，从而抑制其活化。这一系列结果从现象到机制，从整体到细胞再到分子层面，构成了一个完整的证据链。
综上所述，本研究得出明确结论：白虎加桂汤能够显著改善湿热痹阻证类风湿关节炎小鼠的关节功能和炎症水平，其作用机制与上调SIRT1表达，进而抑制NLRP3炎性小体的过度活化密切相关。这项研究的意义和价值体现在多个方面：在科学价值上，它首次从SIRT1/NLRP3炎性小体轴的角度阐明了白虎加桂汤治疗RA（湿热痹阻证）的现代分子机制，为中医药“清热除湿、通络止痛”功效提供了具体的生物学解释，推动了中医理论的现代化阐释。在应用价值上，该研究为白虎加桂汤的临床推广应用提供了扎实的实验依据，增强了其治疗RA的说服力。同时，SIRT1-NLRP3这一作用靶点的发现，也为研发治疗RA（特别是湿热证型）的新型靶向药物提供了新的思路和潜在方向。
本研究的亮点突出：首先，在研究思路上，创新性地采用了“病证结合”的动物模型（CIA+湿热环境刺激），使实验模型更贴近临床RA湿热痹阻证的实际病理状态，提高了研究结论的外推性和中医特色。其次，在研究方法上，成功整合了网络药理学、转录组学（RNA-Seq）和经典的分子细胞生物学技术，形成了一套“预测-验证-深化”的系统性研究策略。这种多组学、多技术融合的研究范式，是现代中药复方机制研究的典范。最后，在发现上，不仅证实了白虎加桂汤通过抑制NLRP3炎性小体发挥抗炎作用，更深入揭示了其上游调控因子SIRT1的关键角色，并利用抑制剂实验证实了其必要性，机制研究较为深入。
此外，研究团队在讨论部分也客观指出了本研究的局限性，例如“病证结合”模型仍不能完全模拟所有临床特征，对NLRP3活化的其他上游触发因素（如活性氧ROS、钾离子外流）未作探讨，以及中药复方多成分、多靶点的整体作用模式仍需系统药理学进一步阐释等。这些都为未来的后续研究指明了方向。总体而言，这是一项设计周密、数据翔实、逻辑清晰、具有重要创新价值的优秀研究。