关于《APOE基因敲除高脂血症兔的育种研究》的学术研究报告
一、 研究团队与发表信息
本研究由来自广东省医学实验动物中心、南方医科大学附属广东省人民医院（广东省医学科学院）的黎桂玲、萨楚拉、刘月姝、刘科、朱叶萌、郑佳琳、谭巧燕、邝少松以及通信作者王刚研究员团队主导完成，合作单位包括五邑大学药学与食品工程学院、广东省医学大动物模型重点实验室。该研究于网络首发日期2026年5月29日发表在《中国比较医学杂志》（Chinese Journal of Comparative Medicine）上。
二、 学术背景与研究目的
本研究属于实验动物学与心血管疾病模型交叉领域，聚焦于基因编辑大动物模型的创制与繁育。其背景基于以下关键科学认知：载脂蛋白E（Apolipoprotein E, APOE）是脂质代谢的核心调节因子，其功能缺失与人类高脂血症、动脉粥样硬化等心血管疾病密切相关。APOE基因敲除（Apolipoprotein E knockout, APOE-KO）小鼠模型虽广泛应用，但在生理结构、脂代谢特征等方面与人类存在差异。相比之下，兔的脂代谢谱、心血管系统及动脉粥样硬化病变形成过程与人类更为相似，是理想的心血管疾病研究模型。然而，高效构建并稳定繁育遗传背景清晰、表型明确的APOE基因敲除兔模型，并建立相应的育种技术体系，仍是该领域面临的技术挑战。
因此，本研究旨在：1）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术结合胚胎移植，成功构建APOE基因敲除兔；2）通过系统的基因型筛选、表型分析和繁殖性能评估，培育出遗传稳定、具有显著高脂血症和动脉粥样硬化早期病变表型的APOE-KO兔群体；3）建立一套有效的APOE基因敲除兔育种技术体系，为心血管及相关代谢疾病的机制研究、药物筛选与评价提供至关重要的新型大动物模型。
三、 详细研究流程与方法
本研究流程严谨，环环相扣，主要包括模型构建、繁育扩群、表型鉴定与体系建立四大阶段。
第一阶段：APOE基因敲除兔模型的初步构建与基因型鉴定。
研究首先比对人与新西兰兔的APOE蛋白序列，确认其高度相似性（84.47%），为将兔作为人类疾病模型提供了理论依据。随后，采用成熟的CRISPR/Cas9基因编辑技术，针对兔APOE基因设计特异性单链引导RNA（sgRNA），通过显微注射等技术编辑兔受精卵，再借助胚胎移植技术获得F0代仔兔。对出生的仔兔，研究人员提取基因组DNA，使用针对编辑靶点两侧设计的引物进行PCR扩增，并对产物进行Sanger测序，以鉴定其基因型。结果显示，成功获得了F0代APOE基因杂合敲除兔（APOE+/-），并通过后续交配，在F1代中获得了APOE基因纯合敲除兔（APOE-/-）。测序结果详细展示了不同类型的基因突变（如缺失11bp、17bp等），证实了基因编辑的有效性和多样性。
第二阶段：APOE基因敲除兔的选种与系统性繁育。
获得基础群（F0, F1代）后，研究进入了关键的选种与扩繁阶段。研究人员选择生长健康的F0代APOE+/-兔作为初始种兔，采用近交（如兄妹交配）或回交（与野生型新西兰兔回交后再与基因敲除兔交配）策略进行繁殖。他们详细记录了母兔的窝产仔数、断奶仔数、初生体重和断奶体重，并持续对每一代仔兔进行基因型鉴定。通过这种持续的基因型筛选与定向交配，旨在富集并稳定目标基因型。例如，在F1代，他们使用APOE-/-公兔与APOE+/-母兔交配，或APOE+/-公母兔互交；当在F2代获得APOE-/-母兔后，便采用APOE-/-公兔与APOE-/-母兔纯合子交配。这一过程伴随着对繁殖性能（如产仔数、成活率）和仔兔生长发育的密切监测，并与野生型新西兰兔进行对比，以评估基因敲除对繁殖力的潜在影响。
第三阶段：APOE基因敲除兔的全面表型分析。
这是验证模型有效性的核心环节，包括血液学、血清生化和组织病理学三个层面的分析。
- 血液生理指标检测：对7月龄的APOE-/-兔、APOE+/-兔及同龄野生型（WT）新西兰兔进行耳缘静脉采血。一部分血液用于血常规分析，检测白细胞、红细胞、血小板各亚类的计数与比例。
- 血清血脂生化检测：分离另一部分血液的血清，使用全自动生化分析仪检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C） 这四项关键血脂指标。
- 组织病理学检查：分别采集7月龄和9月龄的APOE-/-兔及对照新西兰兔的心脏（重点观察冠状动脉）和肝脏等组织。组织经4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片后，进行苏木精-伊红（H&E）染色，在光学显微镜下观察组织结构、细胞形态及病理变化，特别是动脉粥样硬化相关病变，如血管壁增厚、内膜泡沫细胞沉积、炎症细胞浸润等。
第四阶段：数据统计分析与育种体系总结。
所有定量数据均以平均数±标准差表示。使用GraphPad Prism 5软件进行统计分析。多组间均值比较采用两因素方差分析（Two-way ANOVA），组间两两比较选用t检验。以P<0.05为有显著性差异，P<0.01为差异极显著。基于从F0到F3代的繁育数据、基因型鉴定结果以及全面的表型分析数据，总结并建立了一套从基因编辑、基因型筛选、选种配种到表型验证的APOE基因敲除兔育种技术体系。
四、 主要研究结果
本研究取得了一系列系统而明确的结果，逐步验证了APOE基因敲除兔作为高脂血症和动脉粥样硬化模型的可行性。
首先，在模型构建与繁育方面：成功建立了APOE-/-兔群体。通过科学的选种繁育策略，突变率逐代提高：F1代为29.17%，F2代升至86.67%，到F3代时，通过APOE-/-纯合子间的交配，后代突变率达到100%，且基因型一致，证明了突变可通过近交或回交稳定遗传。更重要的是，APOE基因敲除兔的繁殖性能（包括窝产仔数、断奶仔数）和早期生长发育（初生重、断奶重、生长曲线）与野生型新西兰兔相比均无显著性差异（P>0.05）。这表明APOE基因的缺失并未对兔的基础繁殖能力和生长造成明显负面影响，为稳定扩繁和维持种群奠定了基础。
其次，在血液表型方面：获得了关键性发现。血脂生化指标显示，在普通饮食条件下，7月龄APOE-/-兔的TC和LDL-C水平极显著高于APOE+/-兔和野生型兔（P<0.01），呈现出典型的脂质代谢紊乱特征。血常规分析揭示了更深层次的系统性变化：与野生型兔相比，APOE-/-兔的白细胞总数、中性粒细胞计数、单核细胞计数显著升高，而淋巴细胞计数显著降低（P<0.01）。这提示APOE缺失不仅导致血脂异常，还引发了显著的系统性炎症状态和免疫细胞比例失衡，这与动脉粥样硬化发病机制中的炎症学说高度吻合。此外，APOE-/-兔的血红蛋白浓度升高、血小板计数降低，可能反映了血液粘稠度改变和氧化应激增强的微环境。
最后，在组织病理学表型方面：研究观察到了进行性加重的动脉粥样硬化早期病变。与血管内膜光滑、结构正常的新西兰兔相比，7月龄APOE-/-兔的心脏冠状动脉已出现血管壁增厚、内皮细胞变性、管壁纤维组织增生。至9月龄时，病变进一步加重，表现为管腔明显狭窄、内皮细胞肿胀脱落、血管内膜下出现泡沫样物质沉积，这是动脉粥样硬化斑块形成的典型早期表现。同时，心肌组织出现局部纤维变性坏死和单核细胞浸润，提示伴随缺血性改变和炎症反应。而肝脏组织未见明显异常，说明病变具有心血管特异性。这些病理变化直观地证实了APOE基因敲除兔能够自发地、渐进性地发展出与人类相似的动脉粥样硬化病理特征。
五、 研究结论与价值
本研究成功制备并筛选出了遗传稳定、表型明确的APOE基因敲除高脂血症兔模型，并建立了一套行之有效的育种技术体系。该模型在普通饮食下即可自发形成严重的高脂血症和动脉粥样硬化早期病变，且繁殖性能良好，能够稳定传代。
其科学价值与应用价值在于：1）提供了更接近人类疾病病理生理过程的大动物模型。相较于小鼠模型，APOE-KO兔的病变进展更缓慢、更具渐进性，与人类慢性心血管疾病的发展过程更为相似，有利于进行长期干预研究。2）为心血管疾病机制研究提供了强大工具。该模型整合了脂质代谢紊乱、慢性炎症和血管病理改变，是研究脂代谢异常、免疫炎症反应与动脉粥样硬化三者间复杂互作的理想平台。3）为药物研发与临床转化奠定基础。兔体型较大，便于进行影像学检查、血液动力学监测、介入手术和重复采样，极大地促进了临床前药效学、药代动力学及安全性评价的转化研究。4）建立的育种体系具有示范意义。其为其他基因编辑大动物疾病模型的构建、选育和保种提供了可借鉴的技术路线和经验。
六、 研究亮点
本研究的突出亮点在于：1）模型表型的系统性与临床相关性：不仅关注核心的血脂指标，还深入揭示了伴随的血液炎症状态和典型的进行性血管病理变化，多层次、多角度地验证了模型的疾病模拟能力。2）育种体系的完整性与实效性：研究并非止步于获得F0代基因编辑动物，而是通过连续数代的基因型筛选、表型评估和繁殖性能监测，建立了一套从创制、扩繁到表型保真的标准化流程，确保了模型种群的遗传稳定性和实验可重复性。3）研究结果的递进性与逻辑性：从基因型鉴定到繁殖性能，再到血液表型和组织病理，结果环环相扣，逐步深入地描绘出APOE基因敲除兔作为疾病模型的全面特征，论证充分。
七、 其他有价值内容与展望
作者在讨论部分也客观指出了本研究的局限性及未来方向：1）目前研究聚焦于心血管相关表型，未来需结合代谢组学等技术，探究APOE缺失对肝肾等器官代谢的潜在影响。2）长期近交繁殖可能存在遗传漂变风险，需通过扩大种群规模来维持遗传多样性。3）本研究在普通级动物中进行，未来可在无菌或SPF级动物中进一步研究，以阐明APOE基因与肠道微生物群的相互作用关系。这些思考为后续研究的深化和拓展指明了方向。
综上所述，该研究是一项系统性强、完成度高、具有重要转化价值的成果，成功打造了一个用于心血管疾病研究的“利器”，将有力推动相关领域的机制探索和药物开发进程。