关于通脉养心丸通过激活ERK信号通路增强线粒体功能减轻心肌缺血再灌注损伤的研究报告
本研究由天津中医药大学的王炎炎（第一作者，来自中药现代化国家重点实验室、中医药研究院及医学技术学院）、宋志会（第一作者，中医药研究院）、郭流漓（第一作者，中医药研究院）、肖扬（天津中医药大学第二附属医院药学部）、陈瑞（天津中医药大学中医学院）和王怡（通讯作者，中药现代化国家重点实验室、中医药研究院）共同完成。该研究成果已于2026年6月3日在《南方医科大学学报》（Journal of Southern Medical University）上在线首发，预计正式刊载于2026年第46卷第6期，页码为1203-1215。
一、 学术背景
本研究属于心血管疾病，特别是缺血性心脏病（IHD）的基础与转化医学研究领域。心血管疾病是全球主要的死亡原因，其中缺血性心脏病是其主要类型。临床治疗中，通过溶栓、动脉搭桥手术等方式实现缺血心肌的快速再灌注是挽救心肌的关键。然而，再灌注过程本身可能引发心肌缺血再灌注损伤（Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury, MIRI），导致心肌功能障碍和结构损伤，影响治疗效果，成为当前的研究热点。
MIRI的病理机制复杂，涉及炎症、氧化应激、能量代谢紊乱、钙超载、细胞凋亡和铁死亡等多个方面。线粒体作为细胞能量工厂和细胞命运调控中心，在MIRI中扮演着核心角色。MIRI可导致线粒体呼吸链酶活性降低、膜电位下降、线粒体通透性转换孔（Mitochondrial Permeability Transition Pore, mPTP）异常开放，进而释放促凋亡蛋白，引发细胞死亡。因此，保护线粒体功能是治疗MIRI的重要策略。
细胞外信号调节激酶（Extracellular Signal-Regulated Kinase, ERK）是丝裂原活化蛋白激酶家族的重要成员，在细胞生长、分化、应激和死亡中起关键调节作用。已有研究表明，ERK信号通路在介导MIRI相关心脏损伤中发挥重要作用，其激活可以抑制mPTP的过度开放，改善心肌线粒体功能，减少心肌梗死面积，提示靶向ERK信号通路是改善MIRI的潜在策略。
通脉养心丸（Tongmai Yangxin Pills, TMYX）是一种复方中药，由国医大师阮士怡和张伯礼院士根据张仲景《伤寒论》中的炙甘草汤化裁而来，由地黄、鸡血藤、麦冬、甘草等11味中药组成。前期临床研究表明，TMYX能有效减少室性早搏、改善心脏功能，并能减轻冠脉介入术后的心脏重构和功能障碍。团队前期研究也发现TMYX可通过调节cAMP/PKA和PI3K/Akt/eNOS信号通路减少心肌无复流。然而，TMYX改善MIRI的具体分子机制，尤其是其是否通过调控线粒体功能发挥作用，尚未完全阐明。
因此，本研究旨在从动物和细胞水平，深入探究TMYX改善MIRI的作用及其具体机制，特别是聚焦于ERK信号通路和线粒体功能之间的关联，以期为TMYX的临床应用提供更深入的实验依据。
二、 详细研究流程
本研究采用了体内动物模型和体外细胞模型相结合的策略，系统评估了TMYX对MIRI的保护作用及其机制。
1. 体内动物实验部分：
- 研究对象与分组： 使用111只6-8周龄、体重230±20g的雄性SD大鼠。随机分为假手术组（15只）、MIRI模型组（24只）以及TMYX低（1.0 g/kg）、中（2.0 g/kg）、高（4.0 g/kg）剂量治疗组（每组24只）。
- MIRI模型建立与给药： 通过开胸手术，结扎左冠状动脉前降支30分钟造成心肌缺血，然后松开结扎线恢复灌注，建立MIRI模型。假手术组仅穿线不结扎。于再灌注后2小时开始灌胃给药，每日一次，连续14天。模型组和假手术组给予等体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液。
- 评估指标与方法：
- 心功能评估： 在再灌注后120分钟和给药14天后，使用小动物超声系统（Vevo 2100）测量左心室射血分数（EF）和短轴缩短率（FS），并观察心脏血流情况。
- 心肌梗死面积测定： 末次给药后，处死大鼠取心，通过Evans blue-TTC双染法评估心肌梗死面积。计算梗死区面积与危险区面积的比值（IA/AAR）。
- 血清生化指标检测： 采集腹主动脉血，使用全自动生化分析仪检测乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）及其同工酶（CK-MB）水平，评估心肌损伤。使用商业试剂盒检测超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量，评估氧化应激水平。采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平，评估炎症反应。
- 心肌组织病理学检查： 取左心室组织，经固定、脱水、包埋后切片，进行苏木精-伊红（HE）染色，在光学显微镜下观察心肌组织病理学变化。
2. 体外细胞实验部分：
- 细胞培养与TMYX浓度筛选： 使用大鼠心肌细胞系H9c2。首先通过MTT法检测不同浓度（6.125至800 μg/mL）的TMYX水提物对正常H9c2细胞活力的影响，以确定安全浓度范围。随后，在建立的缺氧/复氧（Hypoxia/Reoxygenation, H/R）损伤模型上，测试TMYX对细胞活力的保护作用，最终选定6.125、25和100 μg/mL作为低、中、高剂量用于后续实验。
- H/R模型建立与分组： 将H9c2细胞置于95% N₂和5% CO₂的厌氧环境中缺氧5小时，然后恢复正常培养条件复氧2小时，建立H/R损伤模型。为探究ERK通路的作用，实验分为对照组、H/R组、H/R+TMYX组、H/R+PD98059（ERK抑制剂）组、H/R+TMYX+PD98059组。抑制剂组在造模前用PD98059预处理30分钟，TMYX在造模后立即加入。
- 细胞损伤与线粒体功能评估：
- 细胞损伤评估： 使用MTT法测细胞活力；检测细胞培养上清液中LDH、SOD、MDA水平；使用ELISA试剂盒检测细胞色素c（Cyt-c）含量；使用荧光检测试剂盒检测Caspase-9和Caspase-3的活性；通过流式细胞术（Annexin V-FITC/PI双染）分析细胞凋亡率。
- 线粒体功能相关指标检测： 使用多种荧光探针进行检测：CM-H2DCFDA检测细胞内活性氧（ROS）水平；Fluo-4 AM检测胞质Ca²⁺浓度；Rhod 2-AM检测线粒体Ca²⁺浓度；JC-1检测线粒体膜电位；Calcein-AM检测mPTP开放程度。此外，使用ATP检测试剂盒和ATP酶检测试剂盒分别测量细胞内ATP水平和ATP酶活性。
- 线粒体呼吸功能评估： 使用Seahorse XF24分析仪测量细胞的耗氧率（OCR），通过依次注入寡霉素、FCCP、鱼藤酮/抗霉素A，计算基础OCR、最大OCR、ATP关联OCR、质子漏OCR及储备呼吸能力等参数。
- 蛋白表达分析： 使用Western blotting技术检测H9c2细胞中ERK及其磷酸化形式（p-ERK）的蛋白表达水平，计算p-ERK/ERK比值，以评估ERK信号通路的激活状态。
- 数据分析： 所有数据使用SPSS 17.0软件进行统计分析。符合正态分布和方差齐性的数据以均数±标准差表示，采用单因素方差分析（ANOVA）后进行LSD检验进行两两比较。不符合条件的数据采用非参数Kruskal-Wallis检验。P值小于0.05被认为具有统计学意义。
三、 主要研究结果
1. 体内实验结果：
TMYX治疗显著改善了MIRI大鼠的心脏功能。与模型组相比，TMYX中、高剂量（2.0和4.0 g/kg）能明显提高左心室EF和FS值，增加心脏血流速度和血流量（图1）。Evans blue-TTC染色显示，TMYX中、高剂量治疗能显著减少心肌梗死面积和IA/AAR比值（图1e-g）。在生化指标方面，TMYX中、高剂量能有效降低MIRI大鼠血清中CK、CK-MB、LDH、MDA、TNF-α和IL-1β的水平，同时提高SOD活性（图2a-g）。HE染色结果进一步证实，TMYX中、高剂量治疗减轻了心肌纤维排列紊乱、断裂、炎性细胞浸润和间质水肿等病理损伤（图2h, i）。值得注意的是，低剂量TMYX（1.0 g/kg）仅在降低TNF-α水平方面显示出效果，在其他多数指标上改善作用不显著，提示TMYX的作用存在剂量依赖性。
2. 体外实验结果：
- TMYX减轻H/R诱导的H9c2细胞损伤： H/R处理显著降低了H9c2细胞活力，增加了LDH释放、MDA含量以及Caspase-3、Caspase-9活性和细胞凋亡率，降低了SOD活性和Cyt-c水平。TMYX处理（特别是25和100 μg/mL）能剂量依赖性地逆转这些变化，提高细胞活力，减轻氧化应激和细胞凋亡（图3, 4）。
- TMYX改善H/R诱导的线粒体功能障碍： H/R导致H9c2细胞内ROS和胞质/线粒体Ca²⁺浓度显著升高，线粒体膜电位下降，mPTP过度开放。TMYX处理能有效降低ROS和Ca²⁺水平，提升线粒体膜电位，并抑制mPTP的开放（图5）。在能量代谢方面，H/R损伤降低了细胞的ATP水平和ATP酶活性，并损害了线粒体呼吸功能（如基础OCR、ATP关联OCR和储备能力下降）。TMYX治疗能显著提升H/R细胞的ATP水平、ATP酶活性，并改善线粒体呼吸功能参数（图6）。
- TMYX通过激活ERK信号通路发挥保护作用： Western blotting结果显示，H/R处理增加了H9c2细胞中p-ERK/ERK的比值，而TMYX处理进一步增强了这种激活效应（图7f, g）。当使用ERK抑制剂PD98059后，TMYX对H/R细胞的保护作用被显著削弱。具体表现为：PD98059部分逆转了TMYX降低胞质和线粒体Ca²⁺超载的效应（图7a, b）；减弱了TMYX对mPTP开放的抑制作用（图7c）；并且抵消了TMYX降低细胞凋亡率和提升ATP水平的作用（图7d, e）。这些结果表明，TMYX对线粒体功能的保护作用及其抗H/R损伤效应，在很大程度上依赖于ERK信号通路的激活。
四、 研究结论与意义
本研究得出结论：通脉养心丸通过激活ERK信号通路，增强线粒体功能，从而减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤。
其科学价值在于：
- 阐明了TMYX作用的新机制： 首次在动物和细胞水平系统证实了TMYX可通过激活ERK信号通路来改善线粒体功能（包括稳定膜电位、抑制mPTP开放、减轻钙超载和氧化应激、提升能量代谢），从而对抗MIRI。这为TMYX的临床应用提供了新的、更深入的理论依据。
- 揭示了中药多靶点、多通路的协同作用： 研究指出，TMYX的保护作用可能涉及一个整合的信号网络。ERK和PI3K/Akt作为关键的促生存信号通路，可能在TMYX作用下协同作用；而cAMP/PKA通路可能作为上游调控节点，启动MEK/ERK级联反应。这些通路最终汇聚于改善线粒体功能、抑制氧化应激和细胞凋亡等下游效应，构成了一个综合性的心肌保护信号网络。
- 为MIRI的防治提供了新的潜在策略： 研究强调了ERK信号通路和线粒体功能作为MIRI治疗靶点的重要性，不仅为TMYX这一具体药物的应用提供了支持，也为研发靶向该通路的新型心肌保护剂提供了思路。
五、 研究亮点
- 机制研究的深度与系统性： 研究从整体动物到细胞分子水平，从心功能、梗死面积、病理形态到线粒体膜电位、mPTP、呼吸功能、钙离子浓度、凋亡信号等微观指标，层层递进，逻辑严密地揭示了TMYX通过ERK-线粒体轴发挥心脏保护作用的完整证据链。
- 研究模型的合理应用： 结合了在体MIRI大鼠模型和体外H9c2细胞H/R模型，相互印证，提高了结论的可靠性。
- 关键通路的验证： 通过使用特异性的ERK通路抑制剂（PD98059）进行反向验证，有力证明了ERK通路在TMYX效应中的必要性，使机制阐述更加确凿。
- 对中药复方现代化研究的示范意义： 本研究采用现代生命科学技术，深入探究了经典中药复方的作用靶点和通路，是中医药现代化研究的典型案例。
六、 研究的局限性及未来方向
作者在讨论部分也坦诚指出了本研究的几点局限性：
- 机制细节有待深化： 虽然证明了TMYX通过ERK通路改善线粒体功能，但该通路具体调控线粒体的哪个方面（如生物合成、动力学、质量控制等）尚未明确。
- 信号网络的复杂性： TMYX作为多组分药物，很可能通过多通路网络发挥作用。本研究主要聚焦于ERK通路，未来需要采用组学等更全面的方法揭示其他潜在靶点。
- 剂量效应之谜： 研究观察到TMYX在低剂量（体内1.0 g/kg，体外6.125 μg/mL）效果有限，但未深入探讨其原因。未来需要研究TMYX活性成分的药代动力学、多靶点起效阈值以及低剂量下生物利用度等问题，以优化给药方案。
综上所述，本研究为通脉养心丸治疗心肌缺血再灌注损伤提供了坚实的实验依据，深化了对该药物作用机制的理解，并为相关领域的研究提供了有价值的参考。