本研究由周浪珊（海南大学 南繁学院/三亚南繁研究院）、叶晓雪、刘影、陈银华（海南大学 南繁学院/三亚南繁研究院，通信作者）和胡伟（中国热带农业科学院 三亚研究院/热带生物技术研究所，通信作者）等人合作完成。研究论文《木薯 mebbx15 基因克隆及非生物胁迫响应分析》于2025年发表于《热带生物学报》（Journal of Tropical Biology），其网络首发日期为2026年1月16日。
学术背景
本研究属于植物分子生物学与作物遗传改良领域，聚焦于木薯（Manihot esculenta）这一全球重要的粮食和工业原料作物。木薯虽具备较强的抗逆性，但其生长发育和产量仍常受高盐与干旱等非生物胁迫的严重制约。植物响应逆境的过程复杂，涉及一系列信号传导通路和转录因子的精密调控。其中，B-box型锌指转录因子（B-box-type zinc finger transcription factors）是一类在真核生物中广泛存在的重要调控蛋白。BBX蛋白通常在其N端含有1-2个保守的B-box结构域，部分成员在C端还有一个CCT结构域。这些结构域使其能够参与蛋白互作、核定位及转录调控。已有大量研究表明，BBX蛋白家族成员在拟南芥、大豆、苹果等多种植物的光形态建成、开花时间调控、避荫反应以及应对盐、旱、热等非生物胁迫过程中扮演着核心角色。例如，拟南芥中的BBX24（又称STO）能增强植株的耐盐性；苹果中的MdBBX10受盐和干旱胁迫诱导表达；甘蔗中过表达BBX29能提高植株的耐旱性。然而，在木薯这一重要热带作物中，关于BBX家族基因的功能研究，特别是其在非生物胁迫响应中的具体作用，尚属空白。因此，本研究选取了木薯中的MeBBX15基因为研究对象，旨在通过克隆该基因、分析其基本特性及表达模式，初步探究其在木薯响应高盐和干旱胁迫中的潜在功能，为后续深入解析其分子机制及木薯抗逆育种提供理论依据和候选基因资源。
详细研究流程
本研究流程系统且完整，主要包括以下几个步骤：
第一，试验材料获取与处理。研究以木薯品种‘华南205’（‘SC205’）为材料。为模拟非生物胁迫，设置了高盐（浇灌300 mmol·L⁻¹ NaCl溶液）和干旱（停止浇水）两种处理，并以正常浇水为对照（CK）。在处理后的第0、11、21和26天分别采集叶片样品，液氮速冻后保存于-80°C备用，用于后续的基因表达分析。本氏烟草则用于亚细胞定位实验。
第二，MeBBX15基因克隆与载体构建。首先，从木薯叶片中提取总RNA并反转录合成cDNA。以此cDNA为模板，使用特异性引物（MeBBX15-F/MeBBX15-R）通过PCR扩增目的基因。扩增产物经电泳检测和胶回收纯化后，利用Nimble Cloning试剂盒将其连接到pNC-Green-SuC载体上，构建克隆载体。连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，经菌落PCR筛选和测序验证，获得正确的MeBBX15基因编码区序列，并提取重组质粒备用。
第三，生物信息学分析。利用一系列在线工具对克隆得到的MeBBX15基因及其编码蛋白进行了全面的生物信息学分析。具体包括：使用ExPASy的ProtParam工具预测蛋白质的分子量、等电点等理化性质；使用NetPhos 3.1预测磷酸化位点；使用Protscale分析蛋白的亲疏水性；通过NCBI的保守结构域数据库（CDD）识别蛋白的保守结构域；使用SOPMA和SWISS-MODEL分别预测蛋白质的二级和三级结构。
第四，同源序列比对与系统进化分析。利用NCBI的BLAST工具搜索与MeBBX15蛋白同源性较高的其他植物物种的同源蛋白序列。使用DNAMAN软件进行多序列比对，观察保守结构域。并利用MEGA 12软件，以水稻BBX蛋白为外群，采用最大似然法构建系统进化树，分析MeBBX15在进化上的亲缘关系。
第五，亚细胞定位分析。为了明确MeBBX15蛋白在细胞中的位置，研究构建了pNC-Green-SuC-MeBBX15融合表达载体（GFP标签）。将该重组质粒通过农杆菌GV3101介导的瞬时转化法，注射侵染本氏烟草叶片。侵染后的植株在黑暗条件下培养48-72小时，然后使用激光共聚焦显微镜观察叶片细胞中GFP荧光信号的分布，以确定MeBBX15蛋白的亚细胞定位。
第六，MeBBX15基因表达模式分析。这一部分分为两个方面。其一，组织特异性表达分析：利用实验室已有的木薯不同组织（叶、中脉、须根、侧芽、叶柄、茎）的转录组数据，分析MeBBX15基因在各组织中的相对表达水平。其二，非生物胁迫下表达动态分析：对前述高盐和干旱胁迫处理不同时间点采集的木薯叶片样品，提取总RNA并反转录为cDNA。以Actin基因为内参，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，检测MeBBX15基因在不同胁迫处理下的相对表达量变化。实验设置了三次技术重复，采用2−∆∆Ct方法计算表达量，并进行了统计学显著性分析（p<0.05）。
主要研究结果
第一，基因成功克隆与基本特性。通过PCR成功从木薯‘SC205’中克隆得到MeBBX15基因。测序表明其CDS（编码区序列）全长为1，308 bp，编码一个由435个氨基酸组成的蛋白质。生物信息学预测该蛋白分子量约为48.714 kDa，等电点（pI）为5.20，为不稳定、亲水性蛋白，并含有41个潜在的磷酸化位点。
第二，蛋白质结构域与进化分析。保守结构域分析显示，MeBBX15蛋白在N端（第16-61位氨基酸）含有一个典型的B-box结构域（具体显示为BBOX1_BBX-like和ZF-B_box结构域），在C端（第380-422位氨基酸）含有一个CCT结构域。这一结构特征证实了MeBBX15属于BBX转录因子家族。系统进化树和氨基酸序列比对分析表明，木薯MeBBX15与橡胶树（Hevea brasiliensis）的BBX蛋白（XP_021641605.1）亲缘关系最近，相似性最高。
第三，亚细胞定位。激光共聚焦显微镜观察结果显示，携带GFP标签的MeBBX15融合蛋白的绿色荧光信号特异性地聚集在烟草表皮细胞的细胞核和细胞膜上。这一结果明确表明，MeBBX15蛋白是一个定位于细胞核和细胞膜的蛋白，符合其作为转录因子（主要在核内发挥作用）的潜在特性。
第四，组织表达特异性。基于转录组数据的分析表明，MeBBX15基因在木薯的6个被测组织中均有表达，但其表达水平存在显著差异。该基因在叶片和中脉中的表达量远高于须根、侧芽、叶柄和茎，尤其在叶片中表达量最高。这提示MeBBX15可能在木薯叶片组织的特定生理过程中发挥主要作用。
第五，响应非生物胁迫的表达模式。qRT-PCR分析揭示了MeBBX15在高盐和干旱胁迫下的动态表达模式。与对照（0天）相比，无论是高盐胁迫还是干旱胁迫，在处理后的第11、21和26天，木薯叶片中MeBBX15基因的相对表达量均呈现显著下降的趋势（p<0.05）。这表明MeBBX15的表达受到高盐和干旱胁迫的显著抑制。
研究结论与意义
本研究首次成功克隆了木薯MeBBX15基因，并对其进行了系统的生物信息学、亚细胞定位及表达模式分析。主要结论是：MeBBX15是一个具有典型B-box和CCT结构域的BBX家族转录因子蛋白，主要定位于细胞核和细胞膜；该基因在木薯叶片中优势表达；更重要的是，在高盐和干旱胁迫下，MeBBX15的表达量显著下调。基于此，研究者推测MeBBX15可能在木薯响应高盐和干旱胁迫过程中扮演一个“负调控因子”的角色。即，它可能通过抑制某些胁迫应答通路或参与负反馈调节，来影响木薯对逆境的适应过程。这一发现为理解木薯抗逆分子机制提供了新的线索。
本研究的科学价值在于，填补了木薯BBX转录因子家族功能研究的空白，初步揭示了一个新基因MeBBX15在非生物胁迫下的表达特性及其潜在的负调控功能，为后续深入研究其分子调控网络奠定了基础。其应用价值在于，MeBBX15作为潜在的抗逆负调控因子，可能成为木薯分子育种中一个重要的靶点。通过基因编辑等手段调控其表达，或许能够培育出更具耐盐性或耐旱性的木薯新种质，对于应对全球气候变化带来的逆境威胁、保障粮食安全具有潜在意义。
研究亮点与特色
- 研究对象的创新性：这是首次对木薯MeBBX15基因进行的系统性功能研究，填补了该领域空白。
- 研究思路的系统性：从基因克隆、生物信息学分析、亚细胞定位到组织表达和胁迫响应分析，研究流程完整，层层递进，逻辑清晰。
- 关键发现的启发性：发现了MeBBX15在胁迫下表达下调的现象，并据此提出了其可能作为“负调控因子”的新颖假说，这与许多报道中BBX基因在胁迫下上调起正调控作用的情况不同，提示了该基因功能的特殊性，为后续机制探索指明了有趣的方向。
- 理论与应用结合：研究不仅关注基础生物学问题，也明确了其服务于木薯抗逆育种的潜在应用目标。
其他有价值内容
论文在“讨论”部分不仅详细阐述了本研究的发现，还提出了非常清晰和具有前瞻性的未来研究计划。研究者计划通过DNA亲和纯化测序（DAP-seq）在全基因组范围内筛选MeBBX15直接结合的靶基因；利用酵母单杂交和双荧光素酶报告基因实验验证其与靶基因启动子的结合及调控活性；最终通过构建MeBBX15基因敲除或过表达的木薯株系，结合生理指标（如活性氧积累、抗氧化酶活性、脯氨酸含量等）测定，在体内验证其遗传功能。这套完整的技术路线图为后续研究的深入开展提供了明确的蓝图。