学术研究报告：用于活细胞及小鼠组织切片中内源性甲醛追踪的荧光探针开发
一、研究团队与发表信息
本研究由Yonghe Tang（济南大学荧光探针生物成像研究所、广西大学化学与化学工程学院）、Yuping Zhao（广西大学化学与化学工程学院）和Weiying Lin（通讯作者，济南大学/广西大学）合作完成，发表于Nature Protocols期刊，DOI号为10.1038/s41596-020-0384-7。
二、学术背景与研究目标
甲醛（Formaldehyde, FA）是最简单的活性羰基化合物，在人体内通过组蛋白去甲基化、甲醇氧化等代谢反应自发产生，参与认知能力和空间记忆等神经功能。然而，过量FA与癌症、糖尿病、神经退行性疾病等密切相关。传统检测方法（如质谱、色谱）难以实现活体原位检测，而荧光探针因其高选择性、快速响应和非侵入性成为理想工具。本研究旨在开发两种基于萘酰亚胺（Naphthalimide, NA）的高灵敏度荧光探针（NA-FA和NA-FA-Lyso），用于活细胞和深层组织中内源性FA的动态追踪。
三、研究流程与方法
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探针设计与合成
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化学合成：分为两阶段：（1）4-溴-1,8-萘二甲酸酐与氨基衍生物（正丙胺或4-(2-氨乙基)吗啉）缩合，生成中间体1a/1b；（2）中间体与肼单水合物反应，最终得到探针NA-FA（产率81%）和NA-FA-Lyso（产率77%）。
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设计原理：探针通过肼基与FA特异性结合，抑制光诱导电子转移（Photo-induced Electron Transfer, PET）效应，触发荧光信号增强（NA-FA信号增强900倍，NA-FA-Lyso增强350倍）。
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探针表征实验
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灵敏度测试：在PBS缓冲液中，NA-FA对FA的检测限低至1 μM，响应时间＜30分钟。
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选择性测试：探针对FA的响应显著高于其他活性氧、氨基酸及金属离子（如H₂O₂、GSH、Ca²⁺等）。
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稳定性与pH依赖性：探针在pH 7.4条件下稳定性最佳，且NA-FA-Lyso因吗啉基团的弱碱性可靶向溶酶体。
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生物成像应用
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活细胞成像：
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外源性FA检测：HeLa细胞经40 μM FA处理后，NA-FA显示强绿色荧光（单光子激发488 nm，双光子激发880 nm）。
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内源性FA检测：用FA清除剂NaHSO₃预处理细胞后，荧光信号显著降低。
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亚细胞定位：NA-FA-Lyso与溶酶体标记物（LysoTracker Red）共定位，证实其溶酶体靶向能力。
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组织切片成像：小鼠肝脏切片中，NA-FA成功检测到外源性（40 μM FA处理）和内源性FA（经NaHSO₃抑制），双光子成像显示深层组织的高穿透性。
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四、主要研究结果
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超高灵敏度与选择性：NA-FA对FA的荧光增强倍数（900倍）远超既往探针（如基于2-aza-Cope重排的探针），且不受其他羰基化合物干扰。
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双光子成像优势：NA-FA的双光子激发特性（880 nm）使其在组织切片中实现深层成像（600 μm），信噪比（SNR）显著提高。
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生物学验证：在乳腺癌细胞模型中，探针成功可视化由赖氨酸特异性去甲基化酶1（LSD1）产生的内源性FA，为FA的代谢机制研究提供工具。
五、研究结论与价值
本研究开发的NA-FA和NA-FA-Lyso探针填补了活体FA检测的技术空白，其高灵敏度、双光子兼容性和亚细胞靶向能力为FA的生理与病理研究提供了突破性工具。科学价值体现在：（1）首次实现深层组织中内源性FA的原位成像；（2）为癌症、神经退行性疾病的机制研究提供新方法。应用潜力包括疾病早期诊断和药物筛选。
六、研究亮点
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创新性设计：基于PET效应的萘酰亚胺探针，通过FA触发的肼基缩合反应实现信号放大。
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技术突破：双光子成像与溶酶体靶向技术的结合，解决传统探针穿透深度不足的问题。
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多场景应用：从细胞到组织切片，覆盖FA检测的多种需求。
七、局限性
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探针非比率型，无法定量绝对FA浓度；
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近红外荧光缺失限制体内成像应用。未来需开发比率型或近红外探针以拓展应用场景。
八、其他价值
本文详细提供了探针合成（88 h）、表征（24 h）和生物成像（25 h）的全套实验方案，可作为标准化协议推广。