关于转录组学联合代谢组学揭示低温对婆婆纳活性成分积累调控机制研究的学术报告

本研究由甘肃农业大学生命科学技术学院的金敏睿、周香艳（通讯作者）以及甘肃农业大学农学院干旱生境作物学国家重点实验室的苏衍龙、栗孟飞（通讯作者）共同完成，于2026年6月发表在《中草药》（Chinese Traditional and Herbal Drugs）期刊第57卷第11期。

一、 研究的学术背景

本研究属于植物逆境生理学与药用植物次生代谢调控的交叉领域。婆婆纳（Veronica polita）是一种具有清热、消炎等功效的药用植物，其活性成分（如黄酮类和酚类化合物）是其药效的物质基础。在自然环境中，低温是影响植物生长和次生代谢产物积累的关键非生物胁迫因子之一。已有研究表明，低温对中药材活性成分的影响具有“双刃剑”效应：适度低温可能激活植物的防御系统，促进某些活性成分的合成与积累；而极端或长期低温则可能抑制植物生长并减少次生代谢产物的合成。然而，关于婆婆纳如何响应低温胁迫，以及低温如何调控其活性成分（特别是黄酮和酚类物质）生物合成的分子机制，此前尚缺乏系统深入的研究。因此，本研究旨在通过整合生理生化、转录组学和代谢组学分析，系统探究低温处理对婆婆纳生长、生理特性以及活性成分积累的影响，并从分子水平阐明其调控网络，以期为提高婆婆纳药材质量、挖掘其抗逆基因资源以及理解植物低温适应机制提供理论依据。

二、 详细的研究工作流程

本研究设计严谨，包含多个相互关联的实验步骤，形成了一个从表型到生理、再到分子机制的完整研究链条。

1. 实验材料处理与样品采集：
研究以婆婆纳种子为起始材料。种子经赤霉素处理后，先在15℃下萌发，幼苗移栽后在20℃下培养30天，以获得生长一致的植株。随后，将这些植株置于10℃的低温环境中进行胁迫处理。实验设置了三个关键时间点：处理0天（V0，对照）、处理5天（V5）和处理10天（V10）。每个时间点设置3个生物学重复，每个重复采集3株植株的地上部和地下部，共获得9个样品（如V0-1, V0-2, V0-3等）。这些样品用于后续所有的表型观察、生理指标测定、转录组和代谢组分析。

2. 表型与生理生化指标测定：
在处理的不同时间点，研究人员首先对植株进行了系统的表型观察和生理生化指标测量。

• 表型指标： 测量了株高、根长、鲜重和干重，直观评估低温对婆婆纳生长的影响。
• 生理生化指标： 测定了多项关键指标，以反映植物的胁迫响应和代谢状态。
  • 抗氧化系统： 测定了超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活性，评估植物清除活性氧（ROS）的能力。
  • 膜脂过氧化程度： 通过测定丙二醛（MDA）含量来评估细胞膜受损情况。
  • 光合特性： 测定了叶绿素含量和叶绿素荧光参数（Fv/Fm，反映光系统II最大光化学效率）。
  • 活性成分初筛： 测定了总黄酮、总酚和总糖的含量，初步了解低温对次生代谢产物积累的影响。

3. 靶向代谢组学分析：
为了精确量化特定活性成分的变化，研究采用了基于超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）的靶向代谢组学方法。

• 样品制备： 将冷冻干燥的样品研磨成粉，用预冷的70%甲醇提取过夜，离心取上清液过滤后进样。
• 色谱与质谱条件： 使用Agilent SB-C18色谱柱，以0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈为流动相进行梯度洗脱。
• 目标化合物： 该方法定量分析了16种化合物，包括5种黄酮类（儿茶素、洋蓟素、槲皮素、芦丁、杨梅素）、10种酚酸/酚类（绿原酸、肉桂酸、咖啡酸、没食子酸、芥子酸、阿魏酸、香草酸、对羟基苯甲酸、苯甲酸、香豆酸）和1种三萜酸（熊果酸）。
• 方法学验证： 研究建立了各化合物的标准曲线（线性关系良好，R² > 0.990），并进行了精密度、稳定性、重复性和加样回收率试验，验证了方法的准确可靠。

4. 转录组学分析：
为了从基因表达层面揭示调控机制，对三个时间点的婆婆纳叶片进行了转录组测序（RNA-seq）。

• RNA提取与文库构建： 使用TRIzol法提取总RNA，富集mRNA后打断，合成双链cDNA，经过末端修复、加接头等步骤构建测序文库。
• 测序与数据质控： 在NCBI数据库（登录号PRJNA1376212）提交了测序数据。对原始数据进行质控（使用fastp软件），过滤低质量读段，获得高质量Clean Reads用于后续分析。
• 数据分析流程：
  • 差异表达基因（DEGs）鉴定： 使用DESeq2软件，以 |log2FC| ≥ 2 且 P < 0.05 为标准，筛选V5 vs V0和V10 vs V0的DEGs。
  • 功能富集分析： 对DEGs进行基因本体（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，以了解差异基因主要参与哪些生物学过程和代谢通路。
  • 关键基因筛选： 特别关注了与黄酮类和酚酸类代谢通路相关的DEGs。
• qRT-PCR验证： 为了验证转录组数据的可靠性，随机挑选了15个DEGs（包括黄酮、酚酸、萜类合成相关基因）进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证，以内参基因ACT7进行标准化，结果与转录组趋势基本一致。

5. 多组学整合分析与数据处理：
将生理指标、代谢物含量和基因表达数据进行关联分析，构建低温响应的调控网络。所有数据使用SPSS 19.0进行单因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重比较，使用OriginPro 2021绘图。

三、 主要研究结果

1. 低温对婆婆纳表型、生理及初生代谢的影响：

• 表型与生长： 随着低温处理时间延长（至10天），婆婆纳的株高、鲜重、干重和根长均显著增加，表现出一定的“低温驯化”生长响应。但叶片出现颜色加深、轻微皱缩和部分脱落。
• 生理响应：
  • 抗氧化系统： SOD和POD活性、总黄酮和总酚含量均在处理5天时达到峰值，随后在10天时下降；而CAT活性持续升高。这表明短期低温激活了以SOD/POD和抗氧化物质为主的初期防御，而长期胁迫下可能转向更依赖CAT的途径，且部分防御能力减弱。
  • 膜损伤与光合： MDA含量先降后升，在10天时超过对照，表明长期低温导致了膜脂过氧化加剧。叶绿素含量上升但Fv/Fm下降，说明虽然色素可能积累，但光合系统的核心功能（光化学效率）受到抑制。
  • 能量代谢： 总糖含量持续下降，暗示光合产物供应可能不足以满足胁迫下的能量和合成需求。

2. 低温对婆婆纳特定活性成分积累的影响（代谢组学结果）：
靶向代谢组学揭示了更精细的代谢物变化模式：

• 黄酮类： 芦丁、槲皮素和杨梅素的含量在处理5天时显著升高（分别增加1.18、15.8和1.12倍），10天时下降；儿茶素持续上升，洋蓟素持续下降。聚类分析显示芦丁、槲皮素和杨梅素具有相似的积累模式。
• 酚酸类： 绿原酸在5天时积累最高；咖啡酸、没食子酸、芥子酸、阿魏酸和香草酸含量均随处理时间延长而上升；肉桂酸含量先降后升。
  这些结果说明，低温对次生代谢物的调控具有成分特异性和时间动态性，短期胁迫（5天）更有利于槲皮素、杨梅素等关键黄酮醇的积累。

3. 低温响应的转录组调控图谱：

• DEGs总体特征： 与V0相比，V5和V10分别鉴定出1907个和3121个DEGs。V5时上调基因略多于下调基因，而V10时下调基因数量（2033）远超上调基因（1088），表明长期胁迫导致更多基因表达受到抑制。
• 关键通路富集： KEGG富集分析显示，在V5 vs V0中，DEGs显著富集于“次生代谢物的生物合成”、“苯丙烷生物合成”、“代谢途径”和“植物激素信号转导”等通路。在V10 vs V0中，“次生代谢物生物合成”、“代谢途径”、“光合作用-天线蛋白”和“碳固定”等通路显著富集。这表明，短期低温主要重编程次生代谢（尤其是苯丙烷途径）和激素信号，而长期低温则更多影响基础代谢和光合作用。
• 关键基因鉴定： 研究筛选出与黄酮合成相关的基因（如GT5, JOX2, HO1）和与酚类物质合成代谢相关的基因（如LAC3, AOX4, LPR2, AS1, MT-CO2）。这些基因的表达变化为解释代谢物积累提供了分子线索。

4. 多组学整合揭示的核心调控机制：
通过整合分析，研究提出了婆婆纳响应低温胁迫的核心机制：对苯丙烷/类黄酮代谢通路的精确重编程。

• 短期响应（5天）： 低温信号激活了苯丙烷代谢通路的关键基因（如PAL、4CL、CYP75B1、FLS等），将代谢流导向槲皮素、杨梅素等黄酮醇以及绿原酸等酚酸的生物合成。这些物质作为抗氧化剂，协同被激活的SOD、POD酶系统，共同清除ROS，保护细胞，表现为总黄酮/总酚含量升高，MDA含量降低，植株耐受性增强。
• 长期响应（10天）： 随着胁迫时间延长，部分关键基因表达被抑制，同时光合效率（Fv/Fm）下降导致碳骨架和能量供应受限。这使得苯丙烷/类黄酮代谢流减弱，导致芦丁、槲皮素、杨梅素等部分黄酮含量下降。尽管CAT活性和部分酚酸仍在上升以应对持续的氧化压力，但膜损伤（MDA升高）加剧，表明防御系统开始不足以完全抵消长期胁迫的伤害。
• 基因-代谢物关联： 例如，黄酮合成关键基因ANS的表达模式与芦丁、槲皮素的积累趋势相关；ABA合成关键基因NCED2的上调，暗示ABA信号通路可能参与了低温胁迫下次生代谢的调控。

四、 研究结论与价值

结论： 适度的短期低温胁迫（本研究中为10℃处理5天）能够激活婆婆纳的抗氧化防御系统，并通过对苯丙烷/类黄酮代谢通路的关键基因进行上调表达，促进槲皮素、杨梅素等具有抗氧化活性的黄酮类成分的积累。然而，长期低温胁迫（10天）会导致光合受损、能量供应不足，并可能引发部分基因表达抑制，最终对部分活性成分的持续合成产生不利影响。婆婆纳通过这种阶段性的、动态的转录重编程和代谢重塑来适应低温环境。

科学价值：

1. 机制阐释： 首次从转录组和代谢组整合的角度，系统揭示了婆婆纳响应低温胁迫的分子生理机制，特别是阐明了苯丙烷/类黄酮代谢通路在其中的核心调控作用。
2. 资源评价与栽培指导： 明确了适度低温可以作为提高婆婆纳药材中部分活性成分（如槲皮素、杨梅素）含量的一种潜在栽培调控策略，为优化其生产实践提供了理论依据。
3. 基因资源挖掘： 鉴定了一批与婆婆纳黄酮和酚酸合成及低温响应相关的候选基因（如GT5, JOX2, HO1, LAC3, NCED2等），为后续进行功能验证和分子育种奠定了重要基础。
4. 案例补充： 为理解药用植物“胁迫刺激-次生代谢”的共性规律提供了一个具体案例，特别是支持了低温对药用成分“低促高抑”的双向调控理论。

五、 研究亮点

1. 多组学系统解析： 本研究并非停留在生理表现，而是通过生理生化、靶向代谢组和非模式植物转录组的联合分析，构建了从胁迫信号到表型反应的完整证据链，研究层次深入。
2. 时间动态监测： 设置了0、5、10天三个时间点，清晰捕捉了婆婆纳从短期适应到长期受损的动态响应过程，揭示了机制的阶段性特征。
3. 靶向与非靶向结合： 代谢组学部分采用靶向定量方法，精准获得了16种已知活性成分的绝对含量变化，数据可靠，与药效物质关联更直接。
4. 聚焦关键通路： 通过KEGG富集分析，成功将复杂的基因表达变化收敛到“苯丙烷生物合成”等核心代谢通路，并实现了与代谢物积累数据的有效关联，机制阐释清晰。
5. 研究对象的特殊性： 以藏药常用植物婆婆纳为材料，填补了该物种在逆境生理与分子调控方面研究的空白，具有鲜明的特色和应用导向。

六、 其他有价值的内容

研究在讨论部分，将本发现置于更广阔的学术背景中进行了解读。例如，将婆婆纳中槲皮素等黄酮的积累与辣椒中木犀草素糖苷的低温诱导进行类比；将长期低温导致部分代谢物合成下降的现象与甜叶菊（甜菊糖苷下降）和葡萄（咖啡酸、阿魏酸下降）中的研究联系起来。此外，研究还提出了一个潜在的调控模型假设：低温可能通过激活ABA信号（NCED2基因上调），进而调控MYB、bHLH等转录因子，最终影响苯丙烷途径基因表达和活性成分积累。这为未来的深入研究指明了方向，例如可通过外源ABA处理、关键转录因子鉴定等实验加以验证。