本研究由来自蚌埠医学院的张小晴、李娟、柴烁、高梦梦和李玉云共同完成，其研究成果《bmp4过表达转基因c57bl/6品系小鼠子代造血干细胞归巢能力观察》发表于《山东医药》2019年第59卷第30期。
本研究属于基础医学与干细胞生物学交叉领域，重点关注骨形态发生蛋白4（Bone Morphogenetic Protein 4, BMP4）在成年个体（出生后）造血调控中的功能。研究的学术背景源于对造血干细胞移植（Hematopoietic Stem Cell Transplantation, HSCT）临床应用中所遇瓶颈的思考。尽管HSCT是治疗血液系统恶性疾病的有效手段，但移植物抗宿主病、造血干细胞（Hematopoietic Stem Cell, HSC）来源不足以及归巢和重建效率低下等问题仍然困扰着临床。归巢（homing）是HSCT成功的关键第一步，指输注的HSC能够精准迁移并定植于受体骨髓微环境中的过程。探索调控HSC归巢效率的因素对于改善HSCT疗效具有重要意义。另一方面，BMP4作为转化生长因子-β（TGF-β）超家族成员，早期研究集中于其在骨骼发育和软骨形成中的作用。后续研究发现，在胚胎发育阶段，BMP4对于造血系统的形成至关重要，其基因敲除会导致胚胎期造血衰竭和死亡。然而，BMP4在成年个体骨髓造血稳态及HSC功能，特别是在归巢这一具体环节中的调控作用，尚不明确且存在争议。已有研究表明，小鼠骨髓HSC表面表达BMP的I型和II型受体，暗示BMP信号可能参与出生后造血的调控。因此，本研究旨在构建BMP4过表达的转基因小鼠模型，从HSC归巢这一具体表型入手，探究BMP4基因在成年个体造血微环境中的功能及其可能的分子机制，以期为了解BMP4的生物学作用和改善HSCT效率提供新的实验依据。
该研究采用了严谨的动物实验、细胞生物学和分子生物学相结合的综合技术路线，主要包括三大核心程序。
程序一：BMP4过表达转基因小鼠模型的构建与验证及HSC归巢效率的体内评估。 首先，研究者通过基因工程技术构建了神经特异性烯醇化酶（NSE）启动子驱动的BMP4过表达转基因C57BL/6品系小鼠模型。该模型（NSE-BMP4）的特点是在NSE启动子的调控下，稳定上调BMP4的表达水平。为确保实验的准确性，研究者设计并应用了一对跨内含子的特异性引物，通过常规PCR结合琼脂糖凝胶电泳的方法对繁育后的子代小鼠进行基因型筛选，仅选择能扩增出277 bp特异性条带的子代阳性鼠用于后续实验。此步骤体现了转基因动物研究中严格遗传背景控制的重要性。在评估归巢能力时，研究设计了精密的实验分组。首先，从筛选出的子代BMP4阳性鼠和野生型C57BL/6小鼠中各取5只作为供体鼠，处死后分离骨髓，采用流式细胞术分选出Lin-c-Kit+Sca-1+的造血干细胞群。同时，另取20只野生型C57BL/6小鼠作为受体，接受10 Gy/20g剂量的钴-60（⁶⁰Co）致死性全身辐照以清空自身造血系统。这20只辐照受体鼠被随机分为4组，每组5只：转基因1组（移植转基因供体HSC）、野生型1组（移植野生型供体HSC）、阳性对照组（HSC在体外用CFSE染色后检测，作为技术对照）和阴性对照组（仅注射等量PBS缓冲液，作为背景对照）。在移植时，将分选出的HSC（5×10⁴/只）与荧光示踪剂CFSE共同经尾静脉注射入受体鼠体内。移植16小时后，处死受体鼠，提取骨髓有核细胞（BMNC），上机进行流式细胞分析。通过检测骨髓有核细胞中CFSE阳性细胞所占的百分比，即可定量评估不同来源HSC的归巢效率。该程序创新性地将转基因模型与经典的辐照移植-荧光追踪模型相结合，直接比较了不同BMP4表达背景下HSC的体内归巢能力。
程序二：归巢相关关键分子表达水平的检测。 为了探究归巢表型差异背后的潜在分子机制，研究进行了分子层面的检测。研究者随机选取了3只转基因子代阳性鼠和3只野生型小鼠（分别记为转基因2组和野生型2组）。处死后获取骨髓细胞，分别用于mRNA和蛋白水平分析。在mRNA水平，采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）方法检测了造血归巢关键趋化因子CXCL12（也称SDF-1）的表达量，并以GAPDH作为内参基因进行标准化。在蛋白水平，采用蛋白质免疫印迹（Western Blotting）方法检测了两种与HSC粘附和归巢密切相关的蛋白：整合素α4（Integrin α4, ITGA4）和血管内皮细胞黏附分子1（Vascular Cell Adhesion Molecule-1, VCAM-1）的表达水平。所有结果均通过内参蛋白（β-Tublin或GAPDH）的灰度值进行标准化，并以相对百分比的形式呈现。此程序旨在建立BMP4过表达与下游归巢相关分子通路变化之间的关联。
程序三：数据统计分析。 所有实验数据均以均值±标准差（x ± s）表示。组间比较采用SPSS 17.0统计软件进行t检验。P值小于0.05被认为具有统计学差异。严谨的统计分析为结果的可靠性提供了支撑。
研究取得了多方面的关键结果。首先，在归巢效率这一核心表型上，数据呈现出显著差异。转基因1组（移植转基因HSC）的归巢效率为（0.3520 ± 0.02230）%，野生型1组（移植野生型HSC）为（0.7210 ± 0.0320）%，阳性对照组为（37.2000 ± 0.5560）%，阴性对照组为（0.1013 ± 0.0180）%。统计分析表明，转基因组的归巢效率显著低于野生型组（P<0.05），而两组又均显著高于阴性对照组，证实了移植和检测体系的有效性。这一直接证据表明，在BMP4过表达的背景下，HSC的归巢能力受到了显著抑制。这一发现驱动了后续的机制探索。
其次，分子检测结果揭示了潜在的调控机制。RT-PCR结果显示，转基因2组小鼠骨髓中CXCL12 mRNA的相对表达量仅为（2.547 ± 0.126）%，而野生型2组高达（100.110 ± 3.811）%，两者差异极其显著（P<0.05）。Western Blotting结果显示，转基因2组ITGA4蛋白的相对表达量为（231.0 ± 2.49）%，显著高于野生型2组的（163.9 ± 0.38）%（P<0.05）。而对于VCAM-1蛋白，两组之间的表达量（转基因组：88.47 ± 8.33%；野生型组：92.33 ± 1.98%）无统计学差异。这些结果构成了机制推演的核心数据链：BMP4过表达导致其下游靶分子发生特异性改变——关键趋化因子CXCL12的表达被强烈抑制，而粘附分子ITGA4的表达却反常升高，VCAM-1则保持不变。ITGA4是HSC表面的重要粘附分子，其配体之一是VCAM-1，两者结合有助于HSC锚定在骨髓微环境。CXCL12则是骨髓基质细胞分泌的核心趋化因子，通过与HSC表面的受体CXCR4结合，对HSC产生强大的化学吸引和滞留作用。因此，研究结果暗示，BMP4可能通过不同的信号通路同时负调控CXCL12和正调控ITGA4。然而，在最终的归巢功能输出上，ITGA4的升高不足以弥补CXCL12的急剧下降所导致的趋化信号缺失，从而导致归巢效率的净降低。这解释了表型与部分分子变化看似矛盾的现象，并指向了BMP4信号调控网络的复杂性。
基于上述结果，本研究得出了明确的结论：BMP4过表达会降低转基因C57BL/6品系小鼠造血干细胞的归巢效率。其机制可能与BMP4通过不同信号通路调控归巢相关分子有关，具体表现为强烈抑制CXCL12的表达，同时上调ITGA4的表达，但ITGA4的上调无法补偿CXCL12下调带来的负面影响，最终导致归巢功能受损。这一结论深化了对BMP4在成年造血系统中功能的理解，特别是其在调控HSC动态（归巢）方面的具体作用。研究具有重要的科学价值和应用价值。在科学上，它首次在活体动物模型中系统评估了BMP4过表达对出生后HSC归巢能力的影响，并初步揭示了CXCL12和ITGA4在其中可能扮演的关键角色，为BMP4信号通路在造血微环境中的复杂调控网络提供了新的实验证据。在应用上，该研究提示，在HSCT的供体选择或预处理方案中，需要考虑BMP4信号通路的状态。例如，对于BMP4信号可能异常活跃（如某些病理状态或老年个体）的供体HSC，其归巢潜能可能受限，这为优化HSCT策略、开发旨在改善归巢效率的辅助疗法（如调控CXCL12/ITGA4轴）提供了潜在的实验室依据和新的思路。
本研究的亮点突出。首先，在研究模型上具有创新性。 鉴于BMP4基因敲除的胚胎致死性严重阻碍了对其出生后功能的研究，作者巧妙地采用了“功能获得性”（gain-of-function）的研究策略，构建了BMP4过表达的转基因小鼠模型，成功绕开了胚胎致死障碍，为探究BMP4在成年期的功能提供了一个可行且直观的活体研究平台。其次，研究设计严谨且系统。 从转基因模型的构建与验证，到体内归巢表型的精确量化，再到下游分子机制的初步探索，形成了“表型-机制”紧密结合的完整证据链。特别是体内归巢实验，结合了致死性辐照、荧光标记和流式细胞术定量，方法经典可靠。再次，研究发现具有重要启发性。 研究不仅证实了BMP4过表达抑制归巢这一新表型，更发现了其对CXCL12和ITGA4这一对功能相关但变化趋势相反的分子的差异调控，提出了“失衡补偿”的假说（升高的ITGA4无法补偿下调的CXCL12），这一发现对理解造血微环境中多因子协同与拮抗的复杂调控具有启示意义。最后，研究紧密联系临床问题。 整个研究的出发点和落脚点均围绕改善HSCT疗效这一临床挑战，使其基础研究发现具有明确的转化医学潜力。
此外，文中在讨论部分引用了多项前人研究，将自身发现置于更广阔的学术背景中。例如，引用Khurana等人的研究说明BMP4/Smad通路可负调控CXCL12表达，以及BMP4可通过p38-MAPK非经典通路上调ITGA4，这些文献支持了本研究中观察到的分子变化模式的合理性。同时，研究也提到了与一些既往研究（如BMP4敲低模型未影响生理造血）看似不一致的发现，并指出BMP4对出生后造血的调控尚存分歧，体现了科学讨论的客观性。总之，这项研究为造血生物学和干细胞移植领域贡献了有价值的新知。