本研究的主要作者为张凯乐，指导导师为江明教授，研究单位是新疆医科大学第一临床医学院。该研究作为硕士学位论文于2018年3月完成。

本研究的学术领域属于血液病学和干细胞生物学，聚焦于异基因造血干细胞移植（HSCT）后的关键环节——造血重建。造血微环境，特别是其中的间充质干细胞（MSCs），对造血干细胞（HSCs）的生存、归巢和增殖至关重要。传统的骨髓间充质干细胞（BMSCs）是造血微环境的核心组成部分，但其存在取材有创、增殖能力有限等局限性。近年来，脂肪源间充质干细胞（ADSCs）因其来源丰富、易于获取、增殖能力强且免疫原性低，被认为是一个极具潜力的替代或补充选择。先前的研究（包括本课题组的前期工作）已初步证实ADSCs在体外能够支持造血干/祖细胞的扩增。然而，关于ADSCs是否能在体内有效促进造血干细胞的归巢，从而加速移植后的造血重建，尚需直接的实验证据。因此，本研究旨在通过建立小鼠模型，直观比较ADSCs与BMSCs在体外支持造血干细胞扩增的能力，并首次利用活体荧光标记技术，动态观察ADSCs能否促进经过清髓性预处理的受体小鼠体内造血干细胞的归巢过程。研究目标明确：一是优化造血干细胞的分离技术；二是比较ADSCs与BMSCs在体外长期共培养体系中对Lin-Sca-1+c-Kit+（LSK）造血干/祖细胞增殖的影响；三是通过在体实验，验证ADSCs对LSK细胞体内归巢的促进作用。

本研究的工作流程系统且严谨，包含多个核心步骤。首先，是细胞的分离与培养。研究从C57BL/6雄性小鼠身上获取了三种细胞：从腹股沟和睾丸周围脂肪组织中分离培养ADSCs；从股骨骨髓中分离培养BMSCs；以及从孕鼠胚胎躯干中分离培养成纤维细胞（RF细胞，作为阴性对照）。所有细胞均在标准条件下传代培养至第三代用于后续实验。其次，是造血干/祖细胞（LSK细胞）的高效分选。本研究创新性地采用了磁珠分选与流式细胞分选相结合的两步法。第一步，使用针对多种谱系抗原的抗体混合物（Lineage Cocktail）和磁珠进行阴性分选，快速、大通量地去除骨髓中的成熟细胞，获得富含原始干/祖细胞的Lin-细胞群体。第二步，对Lin-细胞群进行Sca-1和c-Kit抗体染色，再通过流式细胞仪精确分选出高纯度的LSK细胞。这种方法结合了磁珠分选处理量大、对细胞损伤小的优点和流式分选高精度、多参数的优势，旨在提高LSK细胞的获得率和活性。第三部分是体外共培养实验。将分选出的LSK细胞分别接种到预先经丝裂霉素C处理过的ADSCs或BMSCs饲养层上进行共培养。分别在共培养第14天和第35天收集悬浮细胞，进行细胞计数，并利用流式细胞术检测细胞总数中以及Lin-细胞群中Sca-1+和c-Kit+细胞的比例，以评估LSK细胞的增殖情况和干性维持。第四部分，也是关键的体内归巢实验。首先，使用不同的活体荧光染料对细胞进行标记：用CFSE（绿色荧光）标记ADSCs和RF细胞，用DID（红色荧光）标记LSK细胞。接着，建立移植模型：将BALB/c雌性小鼠经致死剂量（8.5 Gy）钴60照射进行清髓性预处理。然后将小鼠随机分为三组：A组（对照组）仅尾静脉输注DID标记的LSK细胞；B组（阴性对照组）共输注DID标记的LSK细胞和CFSE标记的RF细胞；C组（实验组）共输注DID标记的LSK细胞和CFSE标记的ADSCs细胞。输注24小时后处死小鼠，采集其股骨、肝脏、脾脏、肺、心脏、肾脏等组织，经福尔马林固定、石蜡包埋、切片。最后，通过激光共聚焦显微镜观察这些组织病理切片中红色（LSK）和绿色（ADSCs/RF）荧光信号的分布情况，以分析标记细胞在受体小鼠体内的归巢定位。

研究取得了多方面的明确结果。在细胞分选方面，采用磁珠预富集Lin-细胞再进行流式分选的方法，成功获得了高纯度的LSK细胞，分选效率（得率）高达70.9%，证实该联合策略优于传统的单纯流式分选，能够在更短时间内获得更多活性良好的目标细胞。在体外共培养实验中，ADSCs与BMSCs均能支持LSK细胞的长期扩增。在第14天时，ADSCs组与BMSCs组在促进LSK细胞总数增殖方面效果相当，差异无统计学意义。然而，到了第35天，ADSCs组的LSK细胞总数显著高于BMSCs组，差异具有高度统计学意义（P < 0.01）。这有力地证明了在长期培养体系中，ADSCs支持造血干/祖细胞扩增的能力优于BMSCs。与此同时，在整个培养期间，两组中Sca-1+和c-Kit+细胞在总细胞或Lin-细胞群中所占的比例并无显著差异，说明ADSCs与BMSCs在维持LSK细胞干性（即自我更新和早期分化潜能）方面的作用相似。最关键的是体内归巢实验的结果。共聚焦荧光检测显示，在仅输注LSK细胞的A组小鼠各主要脏器（骨髓、脾、肝、肺）中，几乎观察不到红色的DID阳性信号，表明单独输注的LSK细胞在24小时内归巢效率极低或无法被检测到。在共输注LSK和RF细胞的B组中，主要在肝脏和肺脏观察到少量的绿色（RF）和红色（LSK）荧光信号，但分布稀疏，未见明显的组织修复迹象。而在共输注LSK和ADSCs的C组中，观察到了显著的归巢现象：在股骨（骨髓）、脾脏、肝脏和肺脏等多个组织中均发现了密集的绿色CFSE阳性信号（ADSCs）以及与之共定位的红色DID信号（LSK细胞），表明ADSCs能够有效地引导或伴随LSK细胞归巢到这些靶组织。尤为值得注意的是，在肺脏和肝脏中，观察到ADSCs似乎趋向并聚集于受照射损伤的肺泡区域和肝组织区域，提示ADSCs可能还具有趋化至损伤部位并参与组织修复的潜能。这些体内结果直接验证了ADSCs促进造血干细胞归巢的假说。

本研究得出的主要结论是：第一，采用磁珠与流式细胞术相结合的分选技术，能够高效、高活性地获取小鼠LSK造血干/祖细胞，为相关研究提供了优化的细胞分离方案。第二，在体外长期共培养体系中，脂肪源间充质干细胞支持造血干/祖细胞扩增的能力，尤其是在长期（如35天）支持方面，显著优于传统的骨髓间充质干细胞。第三，在清髓性预处理的小鼠体内模型中，脂肪源间充质干细胞能够显著促进造血干/祖细胞向骨髓、脾脏、肝脏、肺脏等组织的归巢。这些发现共同表明，ADSCs不仅是一个优异的体外造血支持细胞，更在体内扮演着引导和辅助造血干细胞定植于适宜微环境的“向导”角色。

本研究的科学价值和应用前景显著。在科学价值层面，它从“体内归巢”这一动态过程提供了ADSCs支持造血的直接可视化学证据，弥补了先前研究多集中于体外实验的不足，深化了对ADSCs在造血微环境中功能的理解。研究提示ADSCs的作用可能超越了单纯的分泌因子支持，可能涉及与HSCs的物理性相互作用、共同归巢以及对损伤组织的趋化与修复，为探索其作用机制（如是否通过CXCL12/SDF-1等归巢相关因子）指明了方向。在应用价值层面，该研究为将ADSCs应用于临床造血干细胞移植的辅助治疗提供了重要的临床前实验依据。ADSCs来源广泛、获取便利、扩增迅速的优势，使其有望成为一种“现货型”的细胞治疗产品，与造血干细胞共移植，可能加速移植后造血重建、降低移植失败风险，并可能通过其免疫调节和组织修复特性减轻移植物抗宿主病（GVHD）或预处理相关组织损伤。

本研究的亮点突出。首先，在研究视角上，创新性地将“体外扩增支持”与“体内归巢促进”两个关键环节相结合进行系统研究，构成了从机制到功能的完整证据链。其次，在技术方法上，开发并验证了“磁珠预富集+流式精分选”的LSK细胞分选策略，提高了实验效率和细胞质量；同时，熟练运用了DID和CFSE双色活体荧光标记技术，实现了对共移植的不同细胞群在受体动物体内分布情况的实时、原位、可视化追踪，研究方法先进、直观。最后，在研究结论上，明确提出了ADSCs在长期体外支持和体内引导归巢方面均优于BMSCs的观点，为脂肪组织作为新型间充质干细胞来源用于造血支持治疗提供了有力的数据支持，具有明确的转化医学意义。