关于不同来源人造血干/祖细胞在NOD/SCID小鼠体内归巢能力差异的研究报告
本文作者为来自中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院及实验血液学国家重点实验室（天津）的杨舟、卢士红、李妍涵、刘斌、王慧君、贾海蓉、郑以州。该研究以题为“不同来源人造血干/祖细胞在NOD/SCID小鼠体内归巢能力的差异”发表在《中华血液学杂志》上。
一、 研究背景与目的
本研究属于实验血液学和造血干细胞移植领域。造血干细胞移植后，输注的造血干/祖细胞（Hematopoietic stem/progenitor cells, HSPC）能否高效归巢至受体骨髓的特定微环境，是决定后续成功植入和造血重建的关键。研究表明，HSPC的归巢潜能与其表面归巢相关分子，尤其是CXC趋化因子受体4（CXCR4）的表达水平密切相关，其与配体基质细胞衍生因子-1α（SDF-1α）构成的轴心是归巢过程的核心机制。
尽管国内外已有诸多研究比较不同来源（如脐血、动员后外周血、骨髓）HSPC的体外迁移能力，但由于各实验室采用的测定系统不同，结论差异很大，甚至相互矛盾。更重要的是，体外迁移能力并不能完全真实地反映体内的归巢能力。因此，为了直接验证并比较不同来源HSPC在活体内的归巢能力差异，并探讨这种体内归巢能力与细胞膜表面CXCR4表达水平之间的相关性，本研究应运而生。
本研究的主要目的在于：第一，直接比较人新鲜脐血、冻存脐血、动员后外周血（mPBSC）及骨髓来源的CD34+细胞在非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠体内的归巢效率差异；第二，检测并比较上述不同来源CD34+细胞表面CXCR4的表达水平；第三，分析体内归巢能力与CXCR4表达水平之间的相关性；第四，观察归巢细胞在小鼠骨髓腔内的空间分布特征。
二、 研究流程与方法
本研究包含一系列严谨的实验流程，主要可概括为以下十个步骤：
流程一：标本来源。 研究纳入四类细胞来源：1. 新鲜脐血：取自足月健康新生儿脐带；2. 冻存脐血：为部分新鲜脐血样本冻存后复苏所得；3. 动员后外周血（mPBSC）：来自健康志愿者，通过皮下注射粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员后采集；4. 骨髓：来自健康志愿者。所有供者均签署知情同意书。
流程二：CD34+细胞的分离与纯化。 脐血采集后6小时内、骨髓采集后立即进行处理。采用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞（MNC），经洗涤后，使用德国美天旎公司的MiniMACS免疫磁珠分选系统对CD34+细胞进行分离纯化。分离后，CD34+细胞的纯度达到(97.0 ± 1.4)%，细胞活力大于95%。新鲜脐血分离出的CD34+细胞悬液，一半用于后续新鲜样本实验，另一半按照程序进行冻存备用。
流程三：冻存与复苏。 参照Larsson等建立的冻存复苏程序对部分脐血CD34+细胞进行冻存，以比较冻存前后细胞特性的变化。
流程四：检测CD34+细胞表面CXCR4表达水平。 采用流式细胞术（FCM）进行检测。具体步骤为：调整每管细胞数为1×10^5个，加入特异性单克隆抗体组合，在4℃避光孵育30分钟。洗涤后，用1%多聚甲醛固定，随后使用美国BD公司的FACSCalibur流式细胞仪进行检测，并用CellQuest软件分析，计算CXCR4阳性细胞的百分比。
流程五：荧光染料标记CD34+细胞。 为了在体内追踪输注的细胞，使用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）荧光染料对拟输注的CD34+细胞进行标记。将细胞与终浓度为5 μmol/L的CFSE在37℃孵育15分钟，随后中止标记并洗涤，重悬备用。
流程六：NOD/SCID小鼠移植。 使用4-6周龄雌性NOD/SCID小鼠。移植前4小时对小鼠进行亚致死剂量（2.5 Gy）的全身照射。将调整好的含1×10^5个CD34+细胞的100 μL细胞悬液，经尾静脉注射给小鼠（每份标本均分注射给3只小鼠）。同时设立注射PBS液的空白对照组。
流程七：体内归巢检测与归巢率计算。 移植后20小时处死小鼠，收集其股骨、胫骨骨髓细胞及脾脏细胞，制备单细胞悬液。通过流式细胞仪检测CFSE标记的人CD34+细胞在小鼠骨髓和脾脏中的比例，并计算归巢效率。
- 骨髓归巢效率 = (小鼠骨髓中的人CD34+细胞百分比 × 收获的小鼠股骨胫骨骨髓细胞总数) / 输注的人CD34+细胞总数 × 100%。公式中考虑了股骨与胫骨占小鼠全身骨髓细胞的比例（约为25%）。
- 脾脏归巢率 = (小鼠脾脏中的人CD34+细胞百分比 × 收获的小鼠脾脏细胞总数) / 输注的人CD34+细胞总数 × 100%。
流程八：骨髓腔内定位观察。 移植后20小时取小鼠股骨，经固定、脱钙、石蜡包埋后制成5 μm厚组织切片，置于荧光显微镜下直接观察CFSE标记的人CD34+细胞在小鼠骨髓腔内的具体分布位置。
流程九：数据统计分析。 所有实验数据以均数±标准差（x ± s）表示。使用SPSS 11.0软件进行统计分析，组间比较采用t检验，相关性分析采用直线相关分析。
流程十：实验重复与质量控制。 研究中提及了样本数量（例如，流式检测样本数为4），并采用了标准化的试剂（如购自美国BD公司的单克隆抗体）和仪器，以确保实验结果的可重复性和可靠性。
三、 主要研究结果
研究获得了一系列重要的定量和定性数据，揭示了不同来源HSPC的生物学特性差异。
结果一：不同来源CD34+细胞表面CXCR4表达水平。 流式细胞术检测显示，四种来源的CD34+细胞其CXCR4表达阳性率存在差异：新鲜脐血为(51.5 ± 8.3)%，冻存脐血为(45.8 ± 7.1)%，动员后外周血（mPBSC）为(53.4 ± 4.9)%，而骨髓来源最高，达(66.8 ± 7.6)%。统计分析表明：1. 新鲜脐血和冻存脐血的CXCR4表达水平均显著低于骨髓来源（P < 0.05）；2. 新鲜脐血与mPBSC来源的CXCR4表达水平无显著差异；3. 冻存复苏后，脐血CD34+细胞表面CXCR4水平略有下降，但与新鲜脐血相比，差异无统计学意义。
结果二：不同来源CD34+细胞在NOD/SCID小鼠体内的归巢效率。 移植后20小时的检测显示，细胞成功归巢至小鼠骨髓和脾脏。
- 骨髓归巢效率：新鲜脐血为(1.70 ± 0.58)%，冻存脐血为(1.44 ± 0.66)%，mPBSC为(2.38 ± 0.69)%，骨髓来源最高，为(3.53 ± 1.27)%。统计分析表明，脐血来源（无论新鲜或冻存）的CD34+细胞在照射后NOD/SCID小鼠骨髓中的归巢效率显著低于骨髓来源者（P < 0.05），也低于mPBSC来源者，但与mPBSC的差异未达到统计学显著性。
- 脾脏归巢率：新鲜脐血为(0.67 ± 0.21)%，冻存脐血为(0.49 ± 0.11)%，mPBSC为(0.64 ± 0.13)%，骨髓为(1.01 ± 0.29)%。骨髓来源的脾脏归巢率显著高于其他三组（P < 0.05）。
这些归巢效率数据为比较不同来源HSPC的体内归巢能力提供了直接的定量证据，并与CXCR4表达趋势（骨髓 > mPBSC ≈ 新鲜脐血 > 冻存脐血）大致相符，提示可能存在关联。
结果三：归巢细胞的骨髓内空间分布。 荧光显微镜观察显示，CFSE标记的人CD34+细胞成功归巢到NOD/SCID小鼠骨髓腔内。一个重要发现是，归巢的细胞并非均匀分布，其中大部分定位于靠近骨骼的骨内膜区域，少部分位于骨髓腔中央区域。这一观察结果直观地展示了归巢的靶向性，与骨内膜区域作为重要造血微环境的理论相吻合。
结果四：体内归巢能力与CXCR4表达的相关性分析。 研究人员将不同来源CD34+细胞的CXCR4表达水平与其在NOD/SCID小鼠骨髓中的归巢效率进行了直线相关分析。结果显示，两者之间呈现正相关趋势，但相关性未达到统计学显著性（r=0.497，P>0.05）。这一结果提示，CXCR4表达水平是影响归巢的重要因素，但可能并非唯一决定因素。
四、 研究结论与意义
本研究得出以下核心结论：
- 表达差异：脐血（无论是新鲜还是冻存）来源的CD34+细胞，其膜表面CXCR4的表达水平均显著低于骨髓来源的CD34+细胞。冻存复苏过程会导致脐血CD34+细胞CXCR4表达水平轻微下调。
- 功能差异：在体内归巢能力上，脐血来源的CD34+细胞在照射后NOD/SCID小鼠骨髓中的归巢效率低于mPBSC和骨髓来源的细胞，其中与骨髓来源的差异具有统计学显著性。
- 分布特征：归巢的人CD34+细胞主要集中分布于小鼠股骨的骨内膜区域，这与该区域富含SDF-1α等归巢相关因子、构成特定造血微环境的理论一致。
- 关系探讨：CD34+细胞膜表面CXCR4的表达水平与其在NOD/SCID小鼠体内的骨髓归巢能力呈正相关趋势，但未达到显著水平，暗示归巢过程受多因素调控。
本研究的科学价值在于：它首次在标准化的NOD/SCID小鼠模型中，系统性地直接比较了四种临床常见来源的人造血干/祖细胞的体内归巢效率，提供了更为接近生理状态的体内功能学数据，弥补了单纯体外迁移实验的不足。应用价值在于：为临床选择造血干细胞移植的细胞来源提供了重要的实验依据。例如，研究提示脐血HSPC归巢能力相对较低，这可能部分解释了脐血移植后植入延迟的现象，也为探索通过上调CXCR4表达或其他策略来增强脐血干细胞归巢和植入效率的研究提供了方向和理论基础。
五、 研究亮点与创新
- 体内直接验证模型：摒弃了争议较大的体外迁移实验，采用NOD/SCID小鼠移植模型，直接、定量地评估不同来源HSPC的体内归巢能力，结论更为可靠。
- 系统性的比较研究：同时涵盖了临床最常用的四种HSPC来源（新鲜脐血、冻存脐血、mPBSC、骨髓），并考察了冻存这一临床常用操作对细胞特性的影响，设计全面。
- 功能与表型结合分析：不仅检测了归巢相关分子CXCR4的表型表达，还将其与体内的归巢功能进行了关联分析，并探讨了不一致的可能原因，研究层次深入。
- 空间定位观察：通过组织切片和荧光显微镜技术，直观展示了归巢细胞在骨髓腔内的特异性分布（骨内膜区域），将归巢效率与归巢的解剖位置联系起来，增强了研究的直观性和说服力。
- 对矛盾结论的深入探讨：研究在讨论部分，没有回避其发现的“CXCR4表达与归巢效率相关性不显著”与部分文献报道不一致的问题，并从HSPC的异质性、归巢过程的非特异性、CXCR4的亚细胞分布、其他归巢分子的参与以及实验方法差异等五个角度进行了深入、合理的分析和解释，体现了科学的严谨性。
六、 其他有价值的内容
在讨论部分，研究者提出了几个重要的观点，深化了对造血干细胞归巢机制的理解：
- 归巢的多因素性：研究指出，归巢过程涉及众多分子，如VLA-4/VCAM-1、整合素家族、黏附分子、金属蛋白酶、透明质酸及其受体等，CXCR4/SDF-1α轴起必要且关键作用，但非唯一因素。这解释了表型与功能不完全对应的现象。
- 冻存细胞的“恢复”潜能：研究发现冻存脐血细胞体内归巢能力与新鲜脐血无显著差异，推测其可能在体内受某些因子（如SDF-1）作用，部分恢复了膜表面CXCR4的表达或功能。这对脐血库建设和临床应用具有积极意义。
- 脾脏作为“中转站”的可能性：研究引用了文献观点，提出归巢于脾脏的造血干细胞后期可能继续迁移至骨髓，这为理解归巢的动态过程提供了一个新的视角。
- 研究的局限性提示：研究者含蓄地指出了本研究的局限性，如样本量、实验方法差异等可能影响CXCR4表达的检测和归巢能力的评估，表明结论仍需更多研究证实，这种态度是科学研究的必要组成部分。